[发明专利]超顺磁性功能颗粒、磁化红细胞及其临床应用

权利要求书

1.一种超顺磁性功能颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

细菌磁颗粒的制备：

1)将趋磁细菌MSR-1菌株进行扩大培养；

a)在培养罐内加入第一培养基，105-110℃灭菌10min，静置1h后，将趋磁细菌MSR-1菌株接种到培养罐中，进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为5.5-6，培养温度为28-30℃，培养时间为3-5天，摇床转速为250-300转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔20min，通入50min氧气；

b)将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，无氧状态进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为6.5-7.0，培养温度为20-25℃，培养时间为2-3天，摇床转速为100-200转/分钟；

所述第一培养基由重量份数为5-10份的谷氨酰胺、1-3份麦芽糖醇、0.5-1份泛酸钙、0.5-1份酪蛋白酸钠、0.2-0.5份磷酸二氢钾、0.5-1份月桂酸肌氨酸和1-2份氯化钠组成；所述第二培养基由重量份数为2-3份蛋白胨、2-5份生物素、1-2份甘氨酸、0.5-1份酒石酸钠、1-2份硝酸铵、1-2份磷酯酰丝氨酸和0.2-0.5份月桂醇硫酸酯钠组成；

2)离心并收集趋磁细菌MSR-1菌株，用Tris-HCl缓冲液悬浮，得悬浮液；离心条件为：转速8000-10000rpm，离心时间5-10min；

3)超声波破碎悬浮液中的细胞；超声波破碎条件为：超声功率250-350w，超声时间2-7s，间隔时间2-7s，超声次数80-100次，重复3次；

4)磁铁吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到的沉淀，超声波清洗，磁铁再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3次，即得细菌磁颗粒；超声波清洗条件为：超声功率70-90w，超声时间2-7s，间隔时间2-7s，超声次数40-60次；

a.活化

(1)取细菌磁颗粒，加入处理剂搅拌条件下反应，反应完成后将产物洗涤至中性；所述处理剂为体积比是40-60：1-3：0.3-1的无水乙醇、氨水和正硅酸乙酯的混合液；

(2)将步骤(1)反应后得到的细菌磁颗粒配成浓度为0.1％～0.3％的溶液，调节溶液pH值至3.0-5.0，向上述溶液中加入浓度为5-15％的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中，搅拌条件下反应，反应完成后将产物洗涤至中性，制得经过处理的细菌磁颗粒；

(3)取经过处理的细菌磁颗粒，加入偶联剂，搅拌反应，过滤，制得活化后的细菌磁颗粒，所述偶联剂为质量比为1:1-1.2的EDC和NHS的混合物；

b.孵育：将活化后的细菌磁颗粒与抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体，加入孵育剂，室温孵育，孵育的条件为：140-160rpm涡旋振荡，室温，反应过夜，所述孵育剂为重量份数比为2:5.5-7.2的壳聚糖和海藻酸钠的混合物；

c.分离：磁铁吸附，洗涤，即得超顺磁性功能颗粒。

2.如权利要求1所述的超顺磁性功能颗粒的制备方法，其特征在于，所述抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：

Ⅰ用红细胞糖蛋白GPA免疫小鼠；

Ⅱ取免疫后的小鼠，通过融合剂与杂交瘤细胞进行融合，将融合后的细胞悬浮于选择培养基中，进行培养；

Ⅲ抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体筛选；

Ⅳ抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体的制备及纯化。

3.如权利要求2所述的超顺磁性功能颗粒的制备方法，其特征在于，所述融合剂为质量比为5.6:1.2的聚乙二醇4000和聚乙二醇1500的混合物；所述选择培养基由DMEM培养液和悬浮溶质组成，所述悬浮溶质及其在DMEM培养液中的浓度为15-25μg/ml牛血清、15-20ng/mlβ-胡萝卜素、1-3ng/ml丙酮酸钠、5-10ng/ml维生素E、5-10ng/ml多聚谷氨酸、2-5μg/ml壳聚糖和25-30ng/ml碱性成纤维细胞。