[发明专利]一种干酪乳杆菌电转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是一种干酪乳杆菌电转化方法。

背景技术

乳杆菌在农业、食品领域具有重大的经济意义以及对动物和人体健康公认的重要性,越来越引起人们 的关注。几个世纪以来,乳杆菌作为重要的益生菌已广泛地应用于食品及饮料加工业,其生物学特性为棒状, 厌氧或微需氧,属易生菌。以乳杆菌作为发酵菌的食品工业所创造出的经济价值占全球总的发酵类食品的 20％。同时乳杆菌也被广泛用于肠、肉类食品的加工和保鲜。乳杆菌通过重建肠道菌群平衡,从而有利于 人类及某些动物宿主恢复并提高健康状态。

由于乳杆菌广泛的工业用途和在医学上的重要意义，对乳杆菌分子遗传学研究成为焦点，特别是利用 基因工程技术，以乳杆菌为载体携带外源基因(如抗原、酶、小肽分子等)到人和动物体内直接产生外源 蛋白质。乳杆菌的遗传操作的先决条件是建立方便和可靠的转化方法。目前乳杆菌的转化方法有原生质体 转化法和电击转化法。原生质体转化法最早出现，但具有繁琐、耗时和不稳定的缺点而被摒弃，一种干酪 乳杆菌电转化方法取代了原生质体转化法，但是仍然不十分完善，尤其是重复性不好，转化率低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干酪乳杆菌电转化方法，以克服传统电转化重复性不好，转化率低的问题。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了一种干酪乳杆菌电转化方法，方法包括了干 酪乳杆菌培养、干酪乳杆菌电转化和转化后再培养，具体步骤为：

干酪乳杆菌培养：

A.从低温冷冻冰箱取出一支加入甘油保存的干酪乳杆菌菌种，在MRS固体培养基上划线，37℃厌氧倒 置培养；

B.用无菌的接菌环挑取在MRS上生长好的菌落至试管里MRS液体培养基中，37℃静止培养过夜；

C.第二日将前一天生长好的菌液1mL转接到50mLMRS液体里，37℃静止生长至菌液600nm处紫外吸 收值为0.5-0.6时，准备干酪乳杆菌电转化；

干酪乳杆菌电转化:

D.将干酪乳杆菌移入50mL离心管里，放到冰盒里静置20分钟后，放到提前预冷到4℃离心机中 5000r/min，5分钟，弃掉上清，留下沉淀；向沉淀里移入40mLEPWB溶液，使沉淀悬浮于EPWB溶液中， 放到提前预冷到4℃的离心机中5000r/min，5分钟，弃掉水相，留下菌体，此步骤重复3次，用40mLEPB 溶液洗涤菌体一次，弃上清；

E.菌体用400μL的EPB溶液重悬，分装500-300μL/支(现用现配)，用于电转；

F.质粒DNA1μg加入到之前制备好的干酪乳杆菌感受态细胞中，轻轻混合，冰浴10分钟；

G.将质粒与干酪乳杆菌感受态转入提前预冷的2mm电击杯中，冰浴10分钟；

H.用滤纸将电转化杯表面擦干，放入电转仪中，调节电压2.3kV、电阻200Ω、电容25μF，脉冲时间 约为4-5ms；

I.向电击杯中快速加入900μL的含有0.5％甘氨酸的MRS，轻轻地用移液器吹吸混合后移到一个无菌 的Eppendorf管中，放到提前调至37℃的80-100rpm/min摇床内孵育1.5-3小时；

转化后再培养:

J.孵育后的混合液离心，留下100μL上清，重新悬浮；然后涂布于含有选择压力的MRS琼脂平板上， 37℃无氧倒置培养24-36小时。

其中，MRS培养基为莫匹罗星锂盐改良MRS培养基，EPWB溶液为：NaH₂PO₄0.6mmol/L和MgCl₂0.1mmol/L 配置而成，EPB溶液为EPWB溶液基础上加入0.3mol/L蔗糖，调节pH为7.4，并灭菌4℃保存。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明公开了干酪乳杆菌电转化的具体方法和步骤，克服了传统电转化重复性不好，转化率低的问题。 2.经过合理优化的干酪乳杆菌电转化方法，可以应用于多种不同外源DNA表达，潜在的推动了生物药物基 因的高效表达。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说 明。

实施例1