[发明专利]棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体、构建方法及其蛋白表达方法

权利要求书

1.棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体，其特征在于，将棘孢木霉的ACC脱氨酶基 因和质粒pPIC9K连接后，转化毕赤酵母构建而成。

2.根据权利要求1所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述 棘孢木霉为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)KpS，保藏单位：中国典型培养物保藏中心， 保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015770，保藏日期：2015年12 月23日。

3.一种如权利要求2所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法，其特 征在于，包括以下步骤：

(1)根据棘孢木霉菌株T203ACC脱氨酶基因，设计特异性引物ACC，以棘孢木霉KpS 基因组DNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物回收纯化，并连接T载体，转化大肠 杆菌感受态细胞，培养筛选单克隆，挑取单克隆扩大培养，得到大肠杆菌菌液，进行质粒抽 提并测序；

(2)根据步骤(1)的测序结果，设计特异性引物T-acdS，以步骤(1)大肠杆菌菌液为 模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物和载体质粒pPIC9K同时双酶切，两个酶切产物连接， 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，培养筛选单克隆，挑取单克隆扩大培养，质粒抽提并酶 切鉴定，酶切鉴定正确的命名为重组质粒pPIC9K-acds；

(3)用Sacl线性化重组质粒pPIC9K-acdS，然后电转化毕赤酵母感受态细胞即得。

4.根据权利要求3所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征 在于，步骤(1)的特异性引物ACC为：

正向引物ACC-FP：5’-CACCATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3’

反向引物ACC-RP：5’-GTCTAAAAGAGAGGAATACGCGTTCAAC-3’。

5.根据权利要求3所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征 在于，步骤(2)的特异性引物T-acdS为：

正向引物T-acdS-FP：5’-TACGTAATGGCTACCCTCAACATCCCCGAAC-3’

反向引物T-acdS-RP：5’-GCGGCCGCGTCTAAAAGAGAGGAATACGCGT-3’。

6.根据权利要求3所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征 在于，步骤(1)的PCR反应体系为：2×EsTaqMasterMix12.5μl，基因组DNA0.5μl、10μM 正向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，补水到25μl；步骤(1)的PCR反应条件为：94℃预 变性4min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸8min。

7.根据权利要求3所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法，其特征 在于，步骤(2)的PCR反应体系为：2×EsTaqMasterMix12.5μl，大肠杆菌菌液1μl、10μM 正向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，补水到25μl；步骤(2)的PCR反应条件为：94℃预 变性8min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸8min。

8.根据权利要求3-7任一项所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的构建方法， 其特征在于，步骤(2)的双酶切体系为：10×QuickCutBuffer5μl、载体质粒pPIC9K或PCR 产物1μg，5U/μl的SnaBⅠ和NotⅠ各1μl，补水到50μl；双酶切条件为：37℃金属浴消化 1h。

9.一种如权利要求1所述的棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体的蛋白表达方法， 其特征在于，具体步骤为：将棘孢木霉ACC脱氨酶毕赤酵母表达载体接种到BMGY液体培 养基中，振荡培养至OD₆₀₀为2-6，离心，弃上清，加BMMY液体培养基重悬，并加入100％ 甲醇诱导表达即得。