[发明专利]检测杂合性DMD基因缺失的方法及所用引物

说明书

本发明公开了一种检测杂合性DMD基因缺失的引物，引物是针对DMD基因的79个外显子区域设计的产物为370‑400bp的特异性引物，每对特异性引物至少有20bp的重叠区，在特异性引物的5’端，设计一段通用序列以及5个连续的N碱基；称为标签。本发明还同时提供了利用上述引物进行的检测杂合性DMD基因缺失的方法。本发明是基于二代测序，利用本发明的方法，可以检测纯合型、杂合型的缺失，从而可以有效的检测DMD遗传病的携带者，从而通过产前诊断、试管婴儿等方法指导孕妇生育健康的婴儿。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种基于二代测序检测基因缺失突变的方法。

背景技术

DMD(Duchenne Muscular Dystrophy)是一种严重的神经肌肉遗传性疾病，一种X染色体连锁隐性遗传病，国内一般称为杜氏型肌营养不良或假肥大型进行性肌营养不良。发病情况比较复杂，约有65％左右与遗传有关，35％为个体突变所致。DMD是肌营养不良中发病率最高的一型。还有一种良性亚型，叫BMD(Becker Muscular Dystrophy)，称为贝克型肌肉营养不良。由于体内能够保留部分的不完整的抗肌萎缩蛋白，患者通常较晚出现症状(5-15岁)，临床表现较轻，发展相对缓慢，病程较DMD更长，全国每年新增约3000名DMD/BMD病人，患者总数约有10万人。

由于基因定位于Xp21.1-p21.3，为迄今为止发现的人类最大基因。该基因的缺失、重复或点突变，造成肌营养不良病人无法合成正常的抗肌萎缩蛋白(Dystrophin蛋白)，肌细胞膜失去完整骨架，造成肌细胞膜损伤，肌肉细胞进行性破坏。临床表现主要为骨骼肌进行性萎缩，肌力逐渐减退，丧失活动能力。由于肌肉细胞呈进行性破坏，若不治疗干预，DMD病人通常在12岁前失去行走能力，最终因心肺功能衰竭在20～30岁死亡。由于体内能够保留部分的不完整的抗肌萎缩蛋白，BMD病人通常较晚出现症状(5-15岁)，临床表现较轻，发展相对缓慢，寿命通常在50岁以上。

由于DMD暂无有效的药物进行治疗，因此，进行孕前筛查然后预防该缺陷病婴儿的出生是最有效的的措施。

然而，DMD是人体最大的基因，包含79个外显子，DMD病人是由于某个(或多个)外显子缺失、重复或点突变造成的。确诊DMD，首选抽血检查遗传基因。这是无创性的并可准确提供多种信息的检测手段。目前的MLPA法可以检测缺失和重复，但存在较大的假阴性情况，而利用二代测序，可以检测点突变以及20bp以内的小片段缺失插入，而对杂合性的大片段缺失和重复则无能为力。而qPCR法只能验证已知的缺失突变，不能对未知区域的缺失进行检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用二代测序技术(包括检测杂合性DMD基因缺失的引物)，对杂合型的DMD基因大片段缺失进行检测；从而找到DMD疾病的携带者。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

对DMD基因的79个外显子区域设计产物为370-400bp的特异性引物，每对特异性引物至少有20bp的重叠区，在特异性引物的5’端，设计一段通用序列(uniseq)以及5个连续的N碱基，称为标签，这样正向和反向各有5个随机的碱基N，总共10个N；uniseqF通用序列为：CTACACGACGCTCTTCCGATCT；uniseqR通用序列为GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC。所有序列都进行锁核酸修饰，引物在life公司(原英俊公司)合成，结构中β-D-呋喃核糖的2'-O、4'-C位通过缩水作用形成刚性结构，从而实现锁核酸修饰；序列如表1所示：

表1、DMD基因的79个外显子的引物序列