[发明专利]一种治疗乙肝的基因药物及其制备方法

权利要求书

1.一种治疗乙肝的基因药物，其特征在于，所述药物是由载体、U6启动子以及表达Cas9蛋白的序列元件和表达sgRNA的序列元件组成，所述载体用于装载U6启动子、Cas9序列和sgRNA序列并使其在细胞中表达。

2.根据权利要求1所述的一种治疗乙肝的基因药物，其特征在于，所述载体包括：质粒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、附加体质粒载体、慢病毒载体以及转座子载体。

3.根据权利要求1所述的一种治疗乙肝的基因药物，其特征在于，所述sgRNA序列包括：目标序列，gRNA骨架序列以及终止信号序列。

4.根据权利要求1所述的一种治疗乙肝的基因药物，其特征在于，所述目标序列包括:Seq-Target1、Seq-Target2、Seq-Target3、Seq-Target4、Seq-Target5、Seq-Target6、Seq-Target7、Seq-Target8、Seq-Target9、Seq-Target10，所述目标序列按5'-3'方向如下：

Seq-Target1：GACTTCTCTCAATTTTCTAG；

Seq-Target2：GGCATAGCAGCAGGATGAAG；

Seq-Target3：GCTGCCAACTGGATCCTGCG；

Seq-Target4：GAAGCGAAGTGCACACGGTC；

Seq-Target5：GTTGATAGGATAGGGGCATT；

Seq-Target6：GCCTGCTAGGTTTTATCCAA；

Seq-Target7：CCTCCAAGCTGTGCCTTGGG；

Seq-Target8：TAAAGAATTTGGAGCTACTG；

Seq-Target9：GGGTTGCGTCAGCAAACACT；

Seq-Target10：TCCTCTGCCGATCCATACTG。

5.根据权利要求1所述的一种治疗乙肝的基因药物，其特征在于，所述Cas9序列经过密码子优化，其序列如序列表SEQIDNO.1所示。

6.一种如权利要求1所述的治疗乙肝的基因药物的制备方法，其特征在于，包括步骤：

A、构建重组载体-Cas9质粒：采用EcoRV和NotI对载体进行双酶切，将酶切后的载体与合成的Cas9序列按照摩尔比例1:10混合，再加入T4DNA连接酶buffer溶液，制得重组载体-Cas9质粒；

B、重组载体-Cas9质粒的转化：将重组载体-Cas9质粒向感受态DH5α细菌中转化，阳性克隆质粒即为测序鉴定好的携带有表达Cas9蛋白的重组载体-Cas9质粒；

C、合成U6-Target-gRNA-CMV序列：首先针对HBV的cccDNA设计出Target靶序列，再将合成的U6序列、gRNA骨架序列以及驱动Cas9表达的CMV启动子序列与Target靶序列连接起来形成U6-Target-gRNA-CMV序列；

D、构建重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒：采用BamHI和EcoRI对载体-Cas9质粒进行双酶切，然后将酶切后的载体-Cas9质粒与合成并退火的U6-Target-gRNA-CMV序列按照摩尔比例1:10混合，在加入T4DNA连接酶buffer溶液，最终制得重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒；

E、重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒的转化：将重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒向感受态DH5α细菌中转化，阳性克隆质粒即为测序鉴定好的装载有U6-Target-gRNA-CMV-Cas9表达序列的质粒。

7.根据权利要求6所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其特征在于，所述步骤B具体包括：

B1、将重组载体-Cas9质粒放置在冰上，并将DH5α细菌放置在冰上解冻，吸取3~5μl重组载体-Cas9质粒加入细菌中混合均匀，放置冰上5~10分钟；

B2、将混合物在42℃水浴热激90秒后放置在冰上冷却2~3分钟，最后加入500μl无菌LB培养基，37℃下振荡培养1小时，之后再涂平板，37℃下培养过夜；

B3、第二天挑取克隆细菌进行测序，测序正确的即为重组载体-Cas9质粒。