[发明专利]一种直接针对互隔交链孢酚的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种互隔交链孢酚的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。

背景技术

互隔交链孢酚（(Altemariol, AOH)是一类具有诱变性、致癌性、基因毒性等多种毒性的小分子化合物，与互隔交链孢酚单甲醚（(Altemariol methyl ether, AME）同属于二苯吡喃酮类衍生物，是链格孢霉次级代谢产物的毒素之一。K.Wollenhaupt等研究了AOH对猪子宫内膜细胞活性的影响，当AOH的添加量为12.5μmol/L时，子宫内膜细胞数量明显减少；当AOH的浓度为3.12μmol/L，细胞的代谢活性到显著影响；Pollock等研究了AOH及AME的亚急性毒性和致畸作用，当用200 mg/kg的浓度注射怀孕8d的黄金仓鼠时，胎鼠平均体重下降，脏器严重坏死，且可观察到AOH与AME存在协同作用。Zhen等研究表明，AOH能够引起胚胎食道鳞状细胞癌变，从而引发食道癌。

链格孢霉广泛的存在自然界中，AOH和AME作为其分较广和产量较高的两种毒素，主要存在于霉变腐烂的谷物、水果及蔬菜中。据报道，在我国食道癌、大骨节病高发病区的粮食真菌调查中，互隔交链孢霉广泛的存在于病区的粮食中；Stinson EE，Scott PM，Lau BPY等分别检测了苹果及其饮料制品中的AOH残留情况，其检出率分别为1/22，17/32，11/11，含量分别为160μg/kg，1.35～5.42μg/kg，0.04～2.40μg/kg；此外橘汁、葡萄汁、无花果干等水果制品中也被检测出互隔交链孢酚。因此，建立快速、简便、灵敏的互隔交链孢酚毒素检测方法尤为重要。

目前，国内外尚未制定互隔交链孢酚毒素在农作物及食品中的限量标准，其有关免疫检测方法的报道也鲜有见闻，而传统的检测方法如气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联和毛细管电泳等不仅费时费力，且操作要求高，不适宜大批量的快速筛选，因此，亟需发明一种针对互隔交链孢酚毒素的快速、简便的检测方法。

发明内容

本发明针对现有技术中互隔交链孢酚检测的不足，提供了一种互隔交链孢酚的半抗原及其相应的人工抗原和抗体。

本发明的另一目的在于提供所述半抗原、人工抗原和抗体的应用。

本发明的另一目的在于提供一种直接检测互隔交链孢酚的免疫分析方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种互隔交链孢酚的半抗原，具有如式（Ⅰ）所示的结构：

式（Ⅰ）中n=1，2。

本发明最大限度的保留了互隔交链孢酚的空间结构，其半抗原只是在原有分子的基础上衍生出带2～3个C原子的羧酸分子手臂，与现有技术相比，本发明的抗原进行动物免疫后得到更优质、高效的抗体。

由于互隔交链孢酚本身的合成难度较大，有关于其半抗原及人工抗原合成也鲜有报道，与其相关免疫检测方法也较少，而现有的互隔交链孢酚检测技术主要以仪器法为主，而仪器法操作复杂，前处理要求高，成本高。利用本发明的人工抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达12.8k，最低检测限为1.15 ng/mL，半抑制浓度为16.5ng/mL，所述抗体具有特异性高、灵敏度好、准确度高等显著优点。

优选地，式（Ⅰ）中所述n为1。

一种互隔交链孢酚的人工抗原，具有如式（Ⅲ）所示结构：

式（Ⅲ）中n=1，2；载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清蛋白或卵血清蛋白。

所述半抗原式（Ⅰ）的制备方法，包括如下步骤：将互隔交链孢酚与具有式（Ⅱ）所示分子式结构的溴代羧酸酯类化合物反应后在碱性条件下水解得到具有式（Ⅰ）所示分子结构的互隔交链孢酚半抗原：

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优选地，所述半抗原式（Ⅰ）的制备方法，包括如下步骤：

S1. 将互隔交链孢酚与具有式（Ⅱ）所示分子式结构的溴代羧酸盐按摩尔比1:1.5溶于适量DMF中；

S2. 加入与溴代羧酸酯等摩尔数的碳酸钾，常温反应3～5h；

S3. 加入适量1M的盐酸终止反应，过滤反应混合物得到白色沉淀，滤液用二氯甲烷萃取3次；

S4. 将S3的白色沉淀溶于二氯甲烷中，与萃取溶液合并后过硅胶柱，用体积比为1:5乙酸乙酯/正己烷洗脱液洗脱，收集洗脱液38℃旋干，得到白色粉末状物质；

S5. 上述白色粉末状物质溶于溶液体积比为1：1四氢呋喃/蒸馏水中，加适量LiOH，于碱性条件下水解12h；