[发明专利]一种非经典分泌蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用

权利要求书

1.一种利用非经典分泌蛋白实现目标蛋白分泌表达的方法，其特征在于：所述非经典分泌蛋白为RDPE，其是来源于瘤胃菌(Ruminococcus sp.)5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RDPE不含有任何经典的信号肽和分泌信号序列，该方法包括以下步骤：

(1)根据Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA的DPEase编码基因rdpe序列进行全基因合成，并在该基因核苷酸序列的5’和3’端分别引入NdeI和BamHI限制性酶切位点，合成好的基因连接到pUC57载体上，获得pUC57-RDPE；

(2)将质粒pUC57-RDPE和pMA5分别进行NdeI和BamHI双酶切处理，胶回收后得到两端分别带有NdeI和BamHI酶切位点的rdpe片段和线性化的pMA5载体，将两者以T4连接酶进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α获得pMA5-RDPE；

(3)以步骤(2)获得的质粒pMA5-RDPE为模板，用引物对pMA5-RDPE-F3/pMA5-RDPE-R3扩增线性化的载体pMA5-RDPE3，将PCR产物进行胶回收后以T4多聚核苷酸激酶进行处理，然后加入T4连接酶以使载体自连；将连接体系转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pMA5-RDPEL，其中pMA5-RDPE-F3序列为GGATCCTCTAGAGTCGAGCTCAAGC，pMA5-RDPE-R3序列为GCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTCAAATACATGTTTTACAAAG；

(4)扩增目标蛋白基因，通过胶回收获得相应的基因片段，所述目标蛋白为枯草芽孢杆菌来源的GroES、DnaK、Pel、PhoA或YwbN，或大肠杆菌来源的PhoA或地衣芽孢杆菌来源的AmyL或真核生物来源的GFP或RFP中的一种；

(5)以步骤(3)获得的质粒pMA5-RDPEL为模板，使用引物对pMA5-RDPEL-F/R进行PCR，通过胶回收获得线性化的载体pMA5-RDPEL，其中pMA5-RDPEL-F序列为GGATCCTCTAGAGTCGAGCTCAAGC，pMA5-RDPEL-R序列为GCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTC；

(6)将步骤(4)获得的目标蛋白基因片段与步骤(5)获得的线性化的载体pMA5-RDPEL进行POE-PCR，得到融合产物；

(7)将步骤(6)获得的融合产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得到对应的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP，其中TP代表目标蛋白，该质粒包含组成型强启动子P_HpaII，氨苄青霉素和卡那霉素抗性选择标记基因，及由RDPE的编码序列、21bp的柔性Linker序列和目标蛋白的编码序列融合而获得的DNA序列，其中21bp的柔性Linker序列为5’-GGTAGCGGTGGAGGTGGCAGC-3’；

(8)将步骤(7)获得的重组表达质粒转化入枯草芽孢杆菌中对目标蛋白进行发酵，实现目标蛋白的分泌表达，发酵培养基为2.0％～4.0％蛋白胨、3.0％～7.0％酵母提取物和0.3％～0.9％磷酸氢二钾，pH 7.2；活化所构建重组枯草芽孢杆菌菌株，于37℃、200rpm条件下进行摇瓶发酵。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RDPE是通过非经典分泌途径分泌到胞外，其并非枯草芽孢杆菌中Sec分泌途径和Tat分泌途径等已知经典途径，也不是因为细胞自溶和裂解而导致的胞内蛋白泄漏现象，而是一种未知的全新的蛋白分泌途径。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RDPE作为分泌信号引导目标蛋白实现了在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中所述枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168、WB600、WB700、WB800、1A751、DB104中的一种。