[发明专利]一种特异性抑制连接蛋白26的全人抗体

说明书

本发明提供了一种特异性抑制连接蛋白26的全人抗体，其特征在于，其为重组免疫球蛋白，结构为scFv‑Fc，scFv指的是单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，Fc指的是恒定区。本发明用人连接蛋白26胞外区第41‑56氨基酸序列为抗原，序列为KEVWGDEQADFVCNTL。通过单链抗体噬菌体展示库及筛选技术获得，通过对该抗体的生化分析和免疫荧光鉴定，确定本发明提供的抗体能特异性识别连接蛋白26，并抑制其形成的半通道活性。动物试验表明，该抗体对鼠耳蜗组织切片的半通道活性有显著抑制作用。因此，该抗体可用于连接蛋白突变相关疾病治疗。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体而言本发明提供特异识别人耳蜗、皮肤组织表达的连接蛋白26(Connexin26)抗原，并能阻遏该连接蛋白26形成的半通道的单链抗体及表达该抗体的质粒载体，以及所述单链抗体在制备用于治疗连接蛋白26突变引起的耳聋、皮肤和肿瘤的药物和诊断试剂盒中的应用，本发明还提供利用该抗体制备诊断试剂盒，其包含所述单克隆抗体作为活性成分。

背景技术

离子通道间隙连接是一种细胞与细胞之间的连接。它连接细胞的胞质，允许小于1.8KD的较小分子如离子、代谢产物和第二信使等自由通过^[1，2]。在脊椎动物，由连接蛋白(Connexin)组成的间隙连接通道介导相邻细胞之间离子、小分子营养物质交换及信号分子传播。哺乳动物发育早期已有多种连接蛋白表达，不同连接蛋白组成的间隙连接通道具有不同通透特征，相邻细胞利用间隙连接介导的细胞间通讯或者不依赖间隙连接通道的途径传递发育信号，调节发育过程中的细胞增殖、迁移和分化。连接蛋白是一个广泛表达于脊椎动物细胞的蛋白质家族。该家族成员组成的六聚体定位于细胞膜上，形成间隙连接通道或半通道，介导细胞之间、细胞与细胞外基质之间的物质交换。基因组中编码连接蛋白蛋白家族的基因组成连接蛋白基因家族^[3]。

目前为止在人类基因组中已发现21种连接蛋白基因，小鼠基因组中发现20种连接蛋白基因^[3]，由间隙连接通道和连接蛋白半通道介导的细胞间通讯对许多细胞功能具有重要的作用，包括调节细胞生长，分化和发育^[4-6]。连接蛋白基因的突变与许多人类疾病相关联，包括心血管异常，周围神经病变，白内障和耳聋。连接蛋白26(Cx26)、连接蛋白30(Cx30)参与内耳钾离子循环，并且Cx26和Cx30的缺失引起正在发育中的耳蜗中柯蒂氏器极重度耳聋并伴随细胞死亡^[4，7，8]。Cx26和Cx30由两个相邻基因(GJB2和GJB6)表达，Cx26、Cx30在内耳与非感应细胞连接形成多胞体，两种蛋白在内耳共表达^[9]。DNFB1位于染色体13q11-q12^[10]。50％的习语前失聪都与DFNB1有关，地中海人甚至高达79％^[10，11]。Cx26和Cx30的缺失突变对耳蜗螺旋器的器官形成产生深远影响^[12-14]。连接蛋白的点突变会导致连接蛋白形成的半通道一直处于常开或者常闭状态，导致失聪和皮肤疾病的发生^[15]。特异识别Cx26并恢复其功能的抗体有望恢复连接蛋白突变导致的失聪和皮肤疾病。

近年来单克隆抗体在疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，特别是针对表达特异性抗原的疾病，单克隆抗体与抗原的反应检测可以作为疾病诊断的″金″标准，单克隆抗体作为药物也在自身免疫性疾病和抗肿瘤疾病中发挥重要的作用。

与其他常见疾病不同的是，连接蛋白突变导致的疾病由于发病率相对较低，治疗药物相对较少，另外在耳聋疾病中，由于抗体药物的给药方式存在困难，一直没有针对该靶点的抗体药物上市。用于临床诊断的试剂盒也没有，所以能够识别、结合连接蛋白的单链抗体将成为诊治结直肠癌的重要工具。

参考文献：

1.D.A.Goodenough，D.L.Paul，Gap junctions，Cold Spring HarbPerspectBiol1(2009)a002576.