[发明专利]一种禽传染性支气管炎多表位粘膜免疫疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及用于粘膜免疫的融合蛋白，用于预防禽传染性支气 管炎，其由禽传染性支气管炎病毒IBV主要结构蛋白S1蛋白和N蛋白的多个抗原表位、大肠杆菌不耐热 毒素B亚单位及纯化标签序列组成，及其制备方法和应用。

背景技术

禽传染性支气管炎(AvianInfectiousBronchitis，IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Infectious BronchitisVirus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿 生殖系统和消化系统，感染鸡生长受阻、耗料增加、产蛋下降、死淘率增加，出现呼吸困难、肾脏病变等 症状。本病主要的传播途径是飞沫传染，此外，也可以通过饲料、饮水等经消化道传染。各种日龄、性别 和品种的鸡均易感染，尤以1-4周龄雏鸡最为严重，雏鸡感染后由于呼吸道或肾脏病变而引起死亡，死亡 率高达40％-90％。IB最早于1931年由Schalk和Hawn在美国报道。1936年，Beach和Scbalm证明其病原 为病毒。我国最早于1972年由邝荣禄首次在广东省发现，随后国内大部分省份都有本病发生的报道，至 今为止，该病已呈世界范围流行，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。目前针对IB的防治，尚无 特效疗法，主要通过疫苗来预防，针对IB所用的疫苗品类繁多，有弱毒活疫苗、灭活疫苗以及多价疫苗 等，然而由于本病血清型众多，疫苗免疫效果并不理想，灭活疫苗效果不稳定，传统弱毒苗不能抵抗其他 血清型毒株的攻击，还存在散毒、变异和重组等引起的毒力返强问题。因此，研制安全有效的新型疫苗是 当务之急。

禽传染性支气管炎病毒是冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)第三群禽冠状病 毒的代表株。IBV基因组编码四种结构蛋白：纤突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)和小膜蛋白(E)， 其中纤突蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白是主要的结构蛋白。S蛋白被宿主细胞的蛋白酶切割为S1和S2两条 多肽蛋白。S1亚单位是IBV产生致病性和感染性的主要蛋白，能诱导机体产生血凝抑制抗体、病毒中和抗 体、交叉反应ELISA抗体及细胞介导的免疫应答。N蛋白是唯一位于膜内的蛋白，有助于形成核衣壳，能特 异性地结合到引导RNA上，参与病毒RNA的合成、转录和翻译，此外，N蛋白有免疫识别相关靶位，能诱导机 体产生抗体和细胞介导的免疫应答，在体液免疫和细胞免疫中也起着重要作用。M蛋白是冠状病毒外膜最主 要的成分，在病毒装配时可通过与核衣壳相互作用而将后者结合到囊膜上，与病毒的复制有关。除此之外， M蛋白能控制并介导病毒粒子从粗面内质网(RER)和高尔基体膜出芽，在有补体存在的条件下可以中和病 毒的感染。E基因是以IBV为代表的抗原III群冠状病毒区别于抗原I和II群冠状病毒的主要标志之一，E 蛋白在病毒粒子的组成中需要量很少，在IBV感染细胞中却大量存在，说明E蛋白可能与感染细胞的细胞 凋亡有关，另外在病毒的复制过程中，E蛋白与M蛋白协同作用，参与病毒样颗粒的形成和出芽。

近来兴起的黏膜免疫，不仅可以产生很强的抗体应答，而且还能产生较好的细胞免疫效果。黏膜免疫 需要有黏膜佐剂分子，研究证实霍乱毒素B亚单位(简称CTB)、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位(简称LTB) 均是良好的佐剂分子(LyckeN，EuropeanJ.ofImmunol，1992，22：2277-2281)。

然而，目前尚未见针对禽传染性支气管炎的多表位粘膜免疫疫苗，为了有效预防禽传染性支气管炎， 人们迫切需要一种新型、高效、安全的疫苗。本发明提供了一种新的能用于粘膜免疫的融合蛋白及其疫苗 组合物，能有效预防禽传染性支气管炎病毒的感染。

发明内容

本发明根据不同结构蛋白在病毒感染中的作用，选择主要结构蛋白S1蛋白和N蛋白的多个抗原表位 作为疫苗框架结构，通过柔性Linker连接后再与大肠杆菌不耐热毒素B亚单位串联，克隆入pRSETB载体 后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的禽传染性支气管炎粘膜免疫疫 苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防禽传染性支气管炎病毒的感染。