[发明专利]甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于甘蔗脱毒健康种苗快繁生产技术领域，尤其涉及一种甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法。

背景技术

甘蔗脱毒健康种苗一般指通过生物技术手段而获得的不携带甘蔗宿根矮化病和甘蔗花叶病病原物(以下简称病原物)的甘蔗种苗，其常规技术流程如下：病原物的去除→无菌外植体的建立→丛生芽的诱导→病原检测→健康种苗增殖快繁→生根培养→一级苗圃沙床假植→二级苗圃营养杯假植→大田一级种苗田扩繁→病原检测→合格种苗大田二级种苗田扩繁→病原检测→合格种苗大田三级种苗田扩繁→病原检测→合格种苗，合格种苗即可作为生产用种。在抗甘蔗宿根矮化病和甘蔗花叶病的甘蔗优良新品种面世之前，甘蔗脱毒健康种苗的应用将始终是一项防治甘蔗病原物最为实用和有效的方法，也是世界上各个甘蔗种植国家都在进行研究和利用的技术措施。

从上述技术流程可看出，要培育出合格的甘蔗脱毒健康种苗，无菌外植体的的制备是整个培养过程的关键环节，也是实现工厂化育苗的前提。陈仲华等通过热水处理结合心叶愈伤组织培养，从而建立了一种甘蔗脱毒健康种苗快繁体系，该体系的外植体的制备步骤与常规植物组培外植体的制备步骤基本相同，其过程必须使用到消毒剂氯化汞等。杨本鹏等通过热水处理结合1～2mm的茎尖培养的建立了另一种甘蔗脱毒健康种苗培养体系，其外植体的制备过程同样使用到氯化汞。目前，甘蔗脱毒健康种苗外植体的制备阶段的方法与上述两种方法大同小异。发明人通过多年实践，认为上述两种外植体的制备方法存在如下缺陷：第一种方法的心叶愈伤组织培养出的后代种苗易产生变异，不利于种苗质量稳定；第二种方法以1～2mm大小的茎尖作为外植体，取材难度较大，对技术要求较高，且后续的诱导培养极易出现消毒剂药害及酚类褐化死亡现象，取材及诱导培养成功率较低；同时，两种方法均使用到氯化汞进行外植体消毒，若操作过程处理不当，对操作人员的健康及生态环境均存在潜在不利影响。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种生态、环保且简便易行的甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法，取生长健壮、无病虫为害的植株分割成单芽段，置于52℃温汤中恒温浸泡2h后种植于无菌种源圃；5～7个月后，连续晴天3天以上，取无病原物植株甘蔗的稍部，采用无菌操作切取茎尖端作为无菌外植体。

上述甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法，按以下技术流程进行：熟期甘蔗大田→选取生长健壮、无病虫为害的植株→单芽段→52℃温汤浸泡2h→无菌种源圃种植5～7个月→病原物检测→连续晴天3天以上，取无病原物植株甘蔗的稍部→去除外部包裹的4～5片叶鞘后移至接种室→在超净工作台上每去除一片叶鞘，用75％酒精对外植体基部往尾部擦拭一遍直至露出茎尖端→切取茎尖端0.5～1cm左右的组织接种于外植体培养基上→其它步骤同常规培养。

无菌种源圃为防虫网包围在棚架结构四周形成的与外界隔绝的封闭空间，其目的在于防止病虫对种源圃内培养的植株感染。

防虫网规格为60目。

棚架结构高为4～6m，采用竹竿、塑料管或不锈钢管制作。

针对目前甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体制备存在取材困难和消毒隐患等问题，发明人建立了一种甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法，取生长健壮、无病虫为害的植株分割成单芽段，置于52℃温汤中恒温浸泡2h后种植于无菌种源圃；5～7个月后，连续晴天3天以上，取无病原物植株甘蔗的稍部，采用无菌操作切取茎尖端作为无菌外植体。本发明与常规的外建方法最大的区别在于省去了氯化汞消毒步骤，原因在于：首先，甘蔗梢部本身由层层紧密包裹的叶鞘组成，包裹在其中的茎尖端自然处于无菌状态，只要取材过程进行常规的无菌操作，避免使用带菌的器械接触到茎尖端组织，即可取得无菌外植体；另外，由于单芽段经过52℃温汤浸泡2h，已彻底去除了其中的病原物，因此，只要后续的生长过程不被病原物再次浸染即可获得无病原物的植株，其取材的大小跟去除病原物已无关，因此可以取较大的茎尖作为外植体。本发明生态、环保且简便易行，为甘蔗脱毒健康苗规模化生产提供了无菌外植体取材的好方法。应用本发明可以降低技术操作门槛，省去外植体消毒环节，使生产过程较为生态和环保且可以工厂化培育出质量稳定，无变异的甘蔗脱毒健康种苗；同时，取材的甘蔗外植体更有利于后续阶段的培养，也有利于培育质量稳定的后代种苗且易于实现规模化生产。

具体实施方式