[发明专利]一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测EGFR的新方法，尤其是检测晚期结直肠癌患者外周 血循环肿瘤细胞EGFR的方法。

背景技术

晚期结直肠癌患者，靶向联合化疗可以明显延长晚期结直肠癌无病无进 展生存期和总生存期。晚期结直肠癌患者临床目前应用的靶向药物中。西妥 西单抗是一种靶向EGFR的IgG1单克隆抗体，已在临床上应用，并取得一定疗 效。

EGFR是配体激活受体酪氨酸激酶erB-B家族成员之一，其参与肠黏膜的生 长、增殖和再生，并在结直肠癌的发展过程中起着至关重要的作用。在50％ -85％的结直肠癌标本中EGFR呈阳性表达，并且其表达程度与临床分期、有无 淋巴结转移、无病生存期、总生存期、5年复发率等密切相关。

人EGF受体(humanepidermalgrowthfactorreceptor，HER)家族由4 个成员组成，分别称为HER1(EGFerbB)、HER2(Neu/erbB2)、HER3(erbB3) 和HER4(erbB4)，均属于I型酪氨酸激酶受体基因家族。其蛋白质结构可以 分为3个区域：细胞表面的配体结合区、跨膜区和细胞内的酪氨酸激酶区。 EGFR在缺乏特异性配体时以单体形式存在，但与配体结合后发生聚合。二聚 体形式改变了蛋白质构象，导致酪氨酸激酶活化和受体自身磷酸化，后者通 过JAK-STAT和PI₃K-Akt等转导途径将信号传递到细胞核内，从而促进细胞增 殖，血管生成、转移和抑制细胞凋亡。EGFR与恶性细胞的生长有关，激活EGFR 可以促进肿瘤的生长和进展。

目前常用的EGFR检测方法为免疫组织化学方法，通过检测结直肠癌组织 标本中的EGFR蛋白表达情况判定EGFR状态。免疫组化法是以肿瘤组织为检 测对象，而对于晚期无法获取组织标本的结直肠癌患者，EGFR表达状态评估 变得困难。

发明内容

循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcell，CTC)是从实体肿瘤脱落进入 外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外 周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是 晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC 检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。

研究表明，外周血循环肿瘤细胞与原发瘤细胞活性存在一定的一致性。 目前对于晚期无法获得临床标本结直肠癌患者的治疗仍采用经验用药，为了 避免无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者无法检测EGFR表达，进而不能评 估患者EGFR状态的不足，本发明提供了一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿 瘤细胞EGFR的检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期 结直肠癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测无 法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血CTC的EGFR表达情况。

本发明采用的技术方案如下：

一、利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外 周血中的CTC：

1、采集晚期结直肠癌患者外周血：肘正中静脉血5ml；

2、外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为 0.25％；

3、利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿 瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中， 使其依靠重力自然过滤；

4、过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细 胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液 过滤完全后加入B液，1ml，染色2min，纯水1ml,冲洗2次,取下滤膜，放置 在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC。

二、运用细胞蜡块技术制作薄层切片：

1、脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6 小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按容积比1:1 混匀。

2、包裹：浸泡结束后取出滤膜，用显微镜擦镜纸或滤纸包裹；

3、固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；