[发明专利]一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；

所述数字PCR反应缓冲液A中包括有HBV-B型的引物及探针和HBV-C型的引物及探针；所述数字PCR反应缓冲液B中包括有内标的引物及探针；所述HBV-B型、HBV-C型和内标的引物及探针如下所示：

HBV-B型和HBV-C型通用上游引物：

ctagactcgtggtggacttctc；

HBV-B型和HBV-C型通用下游引物：

atgaggcatagcagcaggat；

HBV-B型探针：tcgcagtcccaaatctccagtcactc；

HBV-C型探针：tcgcagtccccaacctccaatca；

内标上游引物：ctgccgttactgccctgtg；

内标下游引物：ttggtctccttaaacctgtcttg；

内标探针：accaccaacttcatccacgttcacc；

所述HBV-B型探针5’端荧光报告基因为FAM，HBV-C型探针5’端荧光报告基团为VIC，内标探针5’端荧光报告基团为VIC，所有探针3’端淬灭基团均为BHQ；

所述HBV-B病毒基因阳性质控为HBV-B的标准质粒溶液；所述HBV-C病毒基因阳性质控为HBV-C的标准质粒溶液；

所述阴性质控为灭菌生理盐水；

所述内标溶液为β-globin的标准质粒溶液；

所述试剂盒具体使用方法包括如下步骤：

（1）受检样品处理：将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混匀，并于100 ~ 105℃恒温处理10 ~ 16分钟，再于12,000 ~ 14,000rpm/min离心5 ~ 10分钟，取上清液，获得PCR扩增样品DNA模板；

（2）质控品的处理：分别取所述试剂盒中的HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控，按照与步骤（1）相同的方法处理，分别得到HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的DNA模板；

（3）配制数字PCR反应混合液：向步骤（1）和步骤（2）处理后得到的样品DNA模板、HBV-B病毒基因阳性质控DNA模板、HBV-C病毒基因阳性质控DNA模板和阴性质控DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液；其中，阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液均采用数字PCR反应缓冲液A配制，样品的数字PCR反应混合液分为两种，分别采用数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B配制；

（4）将步骤（3）制备的样品、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴，生成的微反应液滴数量为10,000 ~ 20,000个，然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；

（5）读取荧光信号：步骤（4）PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，分别在FAM和/或VIC通道中进行HBV-B和/或HBV-C的分型检测，通过Quanta soft软件进行定量分析，计算出HBV-B型和/或HBV-C型的拷贝数。

2.根据权利要求1所述用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液的成分包括50mM pH 8.3的Tris-HCl、0.5M的NaCl、5 mM 的EDTA、质量浓度2.5%的CTAB和2 mM的DTT。

3.根据权利要求1所述用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应缓冲液A的成分包括4 mM MgCl₂ 、50mM pH8.3的Tris-HCl、300 mMdNTP、900 nM所述HBV-B型和HBV-C型通用上游引物、900 nM所述HBV-B型和HBV-C型通用下游引物、250 nM所述HBV-B探针和250 nM所述HBV-C探针。