[发明专利]一种非诊断目的微生物定性与定量的检测方法

说明书

本发明公开了一种非诊断目的微生物定性与定量的检测方法，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤：确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待测样品中的参考微生物；设计目标微生物类群与目标微生物的特征区域；设计特征区域的多重扩增引物；在待测样品中加入参考微生物与外源核酸后，提取待测样品中的微生物的核酸；利用设计的多重引物扩增微生物核酸，扩增获得特征测序片段；利用特征测序片段定性、定量分析待测样品中微生物。本发明不需要对微生物进行预培养与增殖，可以一次性地对待测样品中的多种已知微生物进行高通量、高准确度、高分辨率的检测，检测过程简单、快速且流程规范。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种非诊断目的微生物定性与定量的检测方法。

背景技术

微生物无处不在，且对微生物的检测应用也十分广泛，包括农业病害鉴定与预测、食品安全检测和医学病原物检测等。

现有微生物定性与定量检测技术包括形态学计数、芯片检测、16S rRNA测序、宏基因组测序和实时定量PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)。形态学计数检测需要对微生物进行预培养，耗时长，不可培养微生物不可检测，一次仅能够检测一种微生物，通量低，在计数时抽样量有限，且结果粗糙，无法对种以下的分类单元进行区分。芯片检测所需的待测样品的DNA量大，需要对微生物进行预培养及富集处理，检测结果不准确，且无法做定量检测。16S rRNA测序无法对种以下的分类单元进行区分。宏基因组测序深度有限，对于低含量的微生物的定量检测准确度很差。实时定量PCR一次只能检测一种微生物，通量低。另外，已有方法共有缺陷是，无法计算微生物定性与定量的可靠性，使得结论实用性差。

发明内容

为了解决现有技术中微生物定性与定量检测不准确的问题，本发明实施例提供了一种非诊断目的微生物定性与定量的检测方法。所述技术方案如下：

本发明实施例提供了一种非诊断目的微生物定性与定量的检测方法，所述方法包括：

确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待测样品中的参考微生物；

根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目标生物的参考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微生物的特征区域和所述参考微生物的特征区域；

制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述目标微生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域的第三多重扩增引物，将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所述第三多重扩增引物混合得到混合多重扩增引物；

向所述待测样品中加入所述参考微生物，获得混合样品；

提取所述混合样品的核酸；

利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩增产物；

利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；

根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行定性和定量分析。

具体地，所述目标微生物类群的数目≥1个，且每个所述目标微生物类群包括≥0种所述目标微生物；

所述目标微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、藻类和原生动物中的至少一种；

所述参考微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、藻类和原生动物中的至少一种。