[发明专利]CRISPR/Cas9靶向敲除人TCAB1基因及其特异性gRNA

说明书

本发明属于分子生物学与生物医学技术领域，具体的说，本发明涉及基于CRISPR/Cas9系统的gRNA序列在引起肿瘤细胞凋亡中的应用。本发明根据CRISPR/Cas9的设计原则，在人基因组上设计了两个靶位点，合成相应的oligos，并且将其构建在px458载体上。在人肝癌细胞株(HepG2)中利用针对这两个靶点设计构建gRNA指导的CRISPR/Cas9系统，可以有效的敲除人TCAB1基因，这一系统易于操作，人TCAB1基因敲除效率高。本发明涉及的gRNA指导CRISPR/Cas9系统有望在治疗肿瘤的新型药物中得到应用。

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医学技术领域，具体涉及基于CRISPR/Cas9系统的gRNA序列在促进肿瘤细胞凋亡中的应用。

背景技术

CRISPR/Cas系统是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展而来，包括三种不同的类型，其中Type II型的CRISPR/Cas系统的DNA内切酶Cas9只有一个亚基，结构最为简单，所以应用也最广泛。除了Cas9蛋白外，该系统还包括两条短的CRISPRRNAs(crRNAs)和trans-activating crRNAs(tracrRNA)。成熟的crRNA-tracrRNA复合体可以通过碱基互补配对指导Cas9蛋白到靶序列上，并在PAM(protospacer adjacent motif)附近特异性剪切DNA双链，形成DSB(double strand break)。DSB可以通过两种途径被修复，一种是非同源重组的末端接合(Non-Homologous End Joining NHEJ)DNA修复方式，另一种是同源重组修复(Homology Directed Repair HDR)方式。NHEJ修复方式可能产生碱基的插入或缺失，从而产生移码突变，或者也可能突变成终止密码子，这些突变形式都可以改变目的基因的开放阅读框；HDR方式需要一段与被剪切片段同源的模板片段来修复DSB，这种修复方式可以将被用来作为模板的同源片段的序列复制到目的基因中，所以可以利用这种修复方式将特定的基因片段引入到目的基因中。

端粒是染色体末端的一段六核苷酸DNA重复序列，被认为是一段沉默基因，它在染色体末端形成类似保护帽结构，避免染色体从末端双链DNA被核酸酶水解，维持遗传物质的稳定性和干细胞及肿瘤细胞的无限增值潜能。而端粒DNA由端粒酶催化合成，合成机制涉及一系列复杂过程，包括酶的生物合成组装、全酶复合物核内的转移定位和活性调控等。端粒酶是一种具有端粒重复序列的核糖核蛋白复合物，它能够识别端粒特定重复序列，并以自身RNA序列为模板，以逆转录的形式合成新的端粒序列以补偿有丝分裂过程中丢失的端粒DNA。

端粒和端粒酶作为维持染色体的稳定的主要结构和细胞寿命的“生物钟”，对于恶性肿瘤的细胞永生化起到重要作用。当细胞发生癌变时，端粒DNA随分裂活动发生渐进性缩短的趋势会启动端粒酶，在端粒酶的作用下，正常的人体细胞可转化成具有无限增值能力的永生化恶性细胞，因此端粒DNA功能的异常是引起细胞衰老和癌变的重要标志之一。

端粒酶卡扎尔体蛋白1(telomerase Cajal body proteinl，TCAB1)是2009年新发现的端粒酶关键核心蛋白组分，它能把端粒酶从卡扎尔体运输到端粒末端的端粒合成目的地，以确保端粒长度维持机制的正常启动。TCAB1表达的缺失虽然不会影响端粒酶逆转录酶(TERT)自身的活性剂对端粒酶RNA组分(TERC)的催化，但可在细胞的S期阻止端粒酶复合物运送至端粒末端合成位点，最终导致端粒的形成和维持受到限制，引起端粒变短，这也意味着癌细胞会更快地死亡。袁平等人(袁平.RNAi沉默TCAB1表达对肺腺癌A549细胞生物学行为的影响[D].浙江大学，2014)利用RNA干扰技术能显著抑制TCAB1 mRNA和蛋白质的表达，沉默TCAB1的表达能抑制肺腺癌细胞A549细胞中端粒酶与端粒的结合，抑制癌细胞增殖，但是该研究结果显示RNAi沉默并不能引起癌细胞凋亡。

发明内容