[发明专利]一种用于筛选具有神经保护活性的药物的细胞模型及其用途和使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于筛选具有神经保护活性的药物的细胞模型，属于医药生物技术领域。

背景技术

随着生命科学的快速发展，基于检测报告基因的药物筛选方法近年来取得了较大的发展和广泛的应用，其涉及完整细胞，在活细胞自然条件下研究药物对生命体功能的影响，更接近体内的生化过程，可以较为准确地了解药物的生物学特性。

神经纤维性病变是世界范围内死亡和长期残疾的主要原因之一，但目前尚无理想有效的治疗药物。中医药在神经纤维性病变病上历史悠久，已有多种中药单体或有效部位以及复方制剂在防治缺血性脑血管病上具有显著疗效。但是，中药治疗神经纤维性病变的确切疗效成分及作用机制均不明确。因此构建神经保护相关的快速、分类筛选模型不仅有助于从中药中寻找和发现治疗神经纤维性病变的有效药物，为新药研发提供新的先导化合物，也可为中药治疗神经纤维性病变的作用机制研究提供一定的前期基础，有利于中医药现代化的发展。

神经纤维性病变的有效治疗主要涉及机体适应神经元的保护/再生等，相关的功能基因为神经生长因子(Nervegrowthfactor,NGF)。NGF具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能，在神经元的损伤修复期，NGF能促进神经纤维的定向生长，促进雪旺细胞及胶质细胞生长，修复髓鞘，保护受损神经元免遭继续损害，减少神经细胞的死亡，支持神经元的存活。鼠NGF已成为临床上常用的治疗神经损伤的药物。若一种物质能使NGF的表达上调，则表明此物质很可能是一种很好的具有神经保护活性的药物。

卢琼报道了基于NGF启动子构建的药物筛选模型，但并没有公开所用的基因片段的碱基序列，本领域技术人员无从知晓此筛选模型的具体结构和构建方法(卢琼，脑缺血药物筛选细胞模型的构建及应用研究，西南交通大学学位论文，2014年)。

发明内容

为了构建一种具有神经保护活性的药物的筛选模型，本发明提供了一种基因构建物。

本发明提供的基因构建物从5’端到3’端依次含有：NGF启动子基因-615bp～+50bp序列和报告基因序列。

以大鼠为例，NGF启动子基因-615bp～+50bp序列详见SEQNO.1：

进一步地，上述报告基因选自：荧光蛋白基因和/或荧光素酶基因。

优选地，上述荧光蛋白基因为绿色荧光蛋白(GFP)基因或红色荧光蛋白(RFP)基因；上述荧光素酶基因为萤火虫荧光素酶基因。

红色荧光蛋白中E2-Crimson较为常用。

本发明进一步提供了一种重组载体，此载体含有上述的基因构建物。

本发明中的载体指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子，常用的有质粒、噬菌体和动植物病毒。

本发明进一步构建了一种稳定的细胞，此细胞含有上述的重组载体或其基因组中整合上述的基因构建物。

进一步地，此细胞选自HEK293细胞、Hela细胞、CHO细胞或干细胞中的任一种。

本发明进一步提供了构建上述重组载体的方法，它包括如下步骤：

(1)合成NGF基因-615bp～+50bp序列；

(2)将步骤(1)合成的序列与带有报告基因的报告载体分别进行酶切，连接报告载体与启动子片段，转化大肠杆菌，抗性筛选，挑选阳性转化子，提取质粒，即得重组载体。

进一步地，步骤(2)中，所述报告载体为带有报告基因的pSC基础质粒。

此处所述的报告基因同上述，即选自荧光蛋白基因和/或荧光素酶基因。

本发明进一步提供了构建上述的稳定的细胞的方法，即将上述的重组载体转染HEK293细胞、Hela细胞、CHO细胞或干细胞中的任一种。

本发明进一步提供了此稳定的细胞的用途，此稳定的可用于筛选可提高NGF表达水平或具有神经保护活性的药物，如各类中药、新化学实体等等。

本发明进一步提供了一种筛选具有神经保护活性的药物的方法，此方法包括如下步骤：

(1)将候选药物给予本发明构建的稳定的细胞；

(2)检测所述细胞中报告基因的表达情况；

(3)判断结果，若所述候选药物能提高报告基因的表达，则表明该候选药物可提高NGF表达水平或具有神经保护活性。

进一步地，

步骤(1)包括将候选药物加入上述构建的稳定的细胞培养体系中共培养；