[发明专利]一种黑痣菌子囊果提取基因组DNA的方法

说明书

本发明公开了一种黑痣菌子囊果提取基因组DNA的方法，与现有技术相比，本发明直接以黑痣菌子囊果为材料，进行DNA提取的方法。在进行DNA提取前，采用裂解液缓冲液处理2次，利用低温下DNA溶解度低的原理去除过多的胶质和多糖，最后加入提取液裂解细胞膜，进行DNA的提取，提取过程中加苯酚‑氯仿‑异戊醇进行抽提去除多余的蛋白。本方法适用于含有胶质和多糖、蛋白等含量高的较高的真菌材料，此类杂质存在和含量对所抽提到的DNA的产量和质量均无明显的影响，为黑痣菌的后续分子研究提供了保证，具有推广使用的价值。

技术领域

本发明涉及一种真菌DNA的提取方法，尤其涉及一种黑痣菌子囊果提取基因组DNA的方法。

背景技术

获取高质量的总DNA是进行分子生物学研究的前提和基础，不少学者对不同类群真菌的的DNA提取方法进行过研究。目前用于真菌DNA的提取方法主要有CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵)和SDS法(十二烷基苯磺酸钠)。主要是通过对真菌的人工分离培养，获得菌丝，继而对菌丝进行DNA的提取。对于用菌丝的提取DNA，以上两种方法广泛应用。不同生物(植物、动物、微生物)的DNA的提取方法有所不同；不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。目前尚缺乏一种适用于绝大多数真菌种类或组织材料的细胞核DNA提取方法。

黑痣菌(Phyllachora)为活体营养型子囊菌，目前尚不能进行人工分离培养，无法获得菌丝进行DNA的提取。只能直接从自然形态—子囊果中提取DNA。但由于子囊果胶质化，富含多糖和蛋白质，严重干扰DNA的提取，采用以往常规DNA提取方法，普遍存在着胶状物质及多糖去处不彻底的缺陷，无法获得高纯度，质量优的细胞核DNA。继而在很大程度上影响了黑痣菌的分子生物学的后续研究工作。因此开发一种能够利用黑痣菌在自然生长条件下子囊果为材料，进行高纯度、高质量DNA的提取方法，已成为当前黑痣菌分子生物学研究的迫切需要。目前，对于从黑痣菌的子囊果中提取DNA的方法的研究很少。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种黑痣菌子囊果提取基因组DNA的方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括以下步骤：

(1)用锋利的刀片将去10-15个子囊果从寄主植物上取下，尽量不带寄主组织，置于离心管内，加少量的二氧化硅和液氮迅速研磨成粉末状；

(2)加入800ul的CTAB-free缓冲液并迅速混匀，置于冰上10min；4℃，9000r/min离心5min，弃上清，步骤(2)重复两次；

(3)加入750ul,65℃预热的CTAB提取缓冲液，充分混匀后置于65℃水浴中1h；

(4)将温浴的材料取出置于室温下，待冷却至室温后加入750μl的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，比例为25:24:1，摇匀3～5min，12000rmp室温离心10min；

(5)将上清液转移至一新的1.5ml的离心管中，再加入等体积的氯仿-异戊醇500-550μl混合液，摇匀3～5min，12000rmp，室温离心10min；

(6)将上清液转移至一新的1.5ml的离心管中，加入350μl的经-20℃预冷的异丙醇，沉降DNA，充分混匀后，于-20℃冰箱中静置保存30min；

(7)将冷冻保存的离心管取出后置于室温中，待温度至室温后12000rmp室温离心10min，可见底部沉降DNA；

(8)弃去上清液，用500μl的70％的乙醇冲洗1-2次，每次12000rmp室温离心1min后弃上清液，干燥后加入灭菌的蒸馏水；

(9)置于-20℃冰箱中保存备用。

本发明的有益效果在于：