[发明专利]一种利用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶制备L-叔亮氨酸的方法

权利要求书

1.一种制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述方法是在含有葡萄糖、底物三甲基丙酮酸反应体系中添加共表达亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的重组菌的粗酶液，搅拌反应；所述粗酶液的制备：(1)构建共表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1的亮氨酸脱氢酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.2的葡萄糖脱氢酶的重组菌；(2)对重组菌进行培养，并诱导菌株表达亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶；(3)将发酵液离心取细胞、洗涤，然后超声破碎，即得粗酶液；所述步骤(1)是：在葡萄糖脱氢酶GDH和亮氨酸脱氢酶LDH之间加入序列如SEQ ID NO.3所示的SD-AS序列得到基因GDH-SD-AS-LDH，然后连接到pET28a质粒上，再转化到大肠杆菌BL21宿主中，得到重组菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中底物三甲基丙酮酸浓度0.5-1.2M，葡萄糖浓度是底物浓度的1.0-1.3倍。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系的温度控制在20-35℃，pH控制在7.5-9.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的时间为1-2.5h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中重组菌进行培养所使用的培养基中添加有辅酶合成路径中的前体物质。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述前体物质是烟酸、烟酰胺、L-色氨酸或L-天冬氨酸中的任意一种或者多种。

7.据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述前体物质是烟酸。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)在葡萄糖脱氢酶GDH和亮氨酸脱氢酶LDH之间加入序列如SEQ ID NO.3所示的SD-AS序列得到基因GDH-SD-AS-LDH，然后连接到pET28a质粒上，再转化到大肠杆菌BL21宿主中，得到重组菌；(2)将重组菌在含有1g/L烟酸的培养基中培养，并诱导菌株表达亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，培养后取菌体细胞、洗涤；(3)在反应体系中，添加底物三甲基丙酮酸浓度1M，葡萄糖浓度是1.2M，30g/L细胞的粗酶液，反应温度是30℃，用氨水控制pH 8.5，反应1.5h。