[发明专利]一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生命科学领域，尤其涉及一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体的制备方法及其相关的应用

背景技术

肿瘤免疫治疗(主要指CTL细胞、DC细胞、CIK细胞、NK细胞、TIL细胞等)是通过激发或调动机体的免疫功能，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞的目的。具有疗效好、毒副作用低或无、无耐药性的显著优势，成为继传统疗法(手术、化疗和放疗)、靶向疗法(小分子靶向药物和单克隆抗体)后肿瘤治疗领域最具前景的研究方向之一。

肿瘤免疫治疗是目前治疗肿瘤最具前景的研究方向之一。通过激发或调动机体的免疫功能，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞的目的。肿瘤免疫治疗主要包括三大类：免疫检验点单抗疗法、过继细胞免疫疗法(ACT)和肿瘤疫苗。目前国际上主要的肿瘤免疫治疗在研药物集中在免疫检验点单抗领域中，特别是负向共刺激因子的抑制剂—CTLA4、PD1等单抗，是全球研发竞赛的焦点。

细胞免疫治疗是世界上肿瘤治疗研究的一个热点，与传统的小分子和单抗药物等生物治疗是一种全新的肿瘤治疗模式，是一种活的药物。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)因其具有靶向杀伤肿瘤细胞的特点而在肿瘤的个体化治疗中占有重要地位。目前常用的肿瘤特异性CTL包括TIL、DC诱导的CTL及基因修饰的T细胞(TCR-T和CAR-T)，能特异性的杀伤表达该抗原的肿瘤细胞，因其出色的疗效，CTL免疫疗法已成为肿瘤个体化治疗的理想方案，但其疗效也受一些限制，如免疫检查点分子PD-1、CTLA-4等。由于肿瘤细胞具有逃避免疫应答的神奇能力，免疫学家也在想方设法激活T细胞的抗肿瘤活性，并保持其发现和攻击癌细胞的能力。肿瘤免疫应答的产生需要机体免疫系统有效识别和提呈肿瘤抗原、进而活化特异性T细胞；共刺激分子及其调节网络在该过程中发挥了极其重要的作用。近几年来，随着对肿瘤免疫抑制机制研究的深入，特别是免疫检查点PD-1、CTLA-4等的发现为提高CTL的疗效提供了新方法。如果通过基因修饰使T细胞直接表达针对PD-1、CTLA-4的特异性抗体则可以阻断肿瘤及肿瘤微环境来源的免疫抑制信号，从而挽救耗竭的T细胞，同时增强CTL杀伤癌细胞的功能；但目前尚无PD-1/CTLA-4双特异性抗体的高效制备方法。

发明内容

本发明针对现有技术之缺陷，提供了一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，以抗PD-1dsFv基因为模板，扩增基因片段PD-1V_H-GGGGS，上下游扩增引物序列如SEQNO.1和SEQNO.2所示；

步骤二，以抗CTLA-4dsFv基因为模板，扩增基因片段GGGGS-CTLA-4V_L，上下游扩增引物序列如SEQNO.3和SEQNO.4所示；

步骤三，OverlapPCR拼接步骤一和步骤二所得基因片段PD-1V_H-GGGGS和GGGGS-CTLA-4V_L，构建基因片段PD-1V_H-GGGGS-CTLA-4V_L，扩增引物序列如SEQNO.1和SEQNO.5所示；

步骤四，以抗CTLA-4dsFv基因为模板，扩增基因片段CTLA-4V_H-GGGGS，上下游扩增引物序列如SEQNO.6和SEQNO.2所示；

步骤五，以抗PD-1dsFv基因为模板，扩增基因片段GGGGS-PD-1V_L，上下游扩增引物序列如SEQNO.3和SEQNO.8所示；

步骤六，OverlapPCR拼接步骤四和步骤五所得基因片段CTLA-4V_H-GGGGS和GGGGS-PD-1V_L，构建基因片段CTLA-4V_H-GGGGS-PD-1V_L，扩增引物序列如SEQNO.7和SEQNO.8所示；