[发明专利]一种微生物谷氨酰胺转氨酶的分离纯化方法

说明书

本发明公开一种新的微生物谷氨酰胺转氨酶的分离纯化方法，将自然筛选得到的新的菌株编号为CGMCC No.10804的茂源链霉菌发酵液经酒精沉淀后，进行阴离子交换层析，再经过脱盐、冷冻干燥后得到所述的微生物谷氨酰胺转氨酶。所得到的谷氨酰胺转氨酶纯度≧90％，内毒素水平≦0.02EU/mL，比酶活在25‑30U/mg之间，回收率≧70％。本发明工艺简单，成本低，酶活回收率高，得到的谷氨酰胺转氨酶纯度高，且此菌株发酵得到的微生物谷氨酰胺转氨酶性质稳定，便于工业化生产，为满足医药级的MTGase的规模化生产提供了一条切实可行的方法。

技术领域

本发明属于生物技术的分离纯化领域，具体涉及一种新的菌种所产谷氨酰胺转氨酶的分 离纯化技术。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglu_tami_nase，简称TGase，EC2.3.2.13)是一种催化酰基转移的转 移酶，可催化蛋白质分子内和分子间ε-(γ-glutaminyl)lysine共价键的形成，从而催化蛋白 质分子内、分子间发生交联，进而改变蛋白质的性质和功能。

谷氨酰胺转氨酶广泛存在于植物、动物和微生物中。最早由学者在豚鼠肝脏中获得TGase， 其在欧洲很长一段时间作为商业TGase的来源。资源稀有和动物来源的TGase复杂的分离纯 化工艺导致酶的价格非常高，以至于不可能应用于工业规模的食品加工中。所以一些学者开 始致力于从微生物中获得这种酶。后来Ando等最早从轮枝链霉菌培养基中发现微生物谷氨 酰胺转胺酶(microbial transglutaminase，MTGase)，从而实现了大规模的发酵生产。同时微 生物来源的谷氨酰胺转氨酶较动植物来源的谷氨酰胺转氨酶有很多优点，如微生物来源的谷 氨酰胺转氨酶是钙非依赖性酶，底物特异性低。这些性质使得MTGase在各个领域得到广泛 的应用。

从1989年Ando等从轮枝链霉菌培养基中得到了谷氨酰胺转氨酶以后，专家学者们陆陆 续续发现其他产TGase的链霉菌，如吸水链霉菌和茂源链霉菌等。不同链霉菌属来源的 MTGase甚至同属不同种的链霉分泌的MTGase的性质也不完全相同。它们的热稳定性及pH 稳定性有着很大的差异，从而影响后期的应用。目前筛选到的产MTGase的链霉菌并不是所 有都可以转化到工业生产中。所以筛选到产酶效率高，MTGase稳定性高的链霉菌的任务迫 在眉睫。而本发明中所提到的从自然界筛选到的茂源链霉菌所产的MTGase稳定性较之前的 发现都要高。

目前微生物来源的MTGase已经运用于工业化生产中。微生物经过发酵产生的MTGase 经过简单的酒精沉淀后就可以运用于食品加工中。但这种方法得到的MTGase纯度低，杂质 含量多且组分复杂。有研究发现，MTGase在生物制药领域有巨大的应用前景。比如MTG可 以催化I型胶原蛋白发生交联，形成耐高温的胶；也可以交联明胶，形成良好的多孔网状物 用于止血和伤口粘合(中国专利：200780051215.4、200980131973.6；美国专利:8133484；欧 洲专利：WO2012017415、EP2303344)；因此微生物谷氨酰胺转胺酶可作为潜在医用止血材 料的交联剂用于止血、伤口粘合等外科手术中。但是，运用于食品领域的MTGase的纯度并 不满足医药级别的要求。同时现有的传统分离纯化工艺复杂，成本高，制备过程中酶的得率、 纯度以及比活力都不高，仍含有多种杂蛋白，难以满足作为医用材料的要求。本发明克服了 目前存在的问题，得到了一条简单成本低的纯化工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低、回收率高、纯度高、适用于工业化生产且满足医药 级要求的微生物谷氨酰胺转胺酶纯化方法，解决目前谷氨酰胺转胺酶纯化工艺复杂、成本高、 回收率低、纯度低的问题。本发明方法分离纯化得到的微生物谷胺酰胺转胺酶符合医药级的 要求。