[发明专利]一种多基因重组嵌合抗原受体分子

说明书

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种多基因重组嵌合抗原受体分子；本发明的多基因重组嵌合抗原受体分子，包括：1)两个通过连接肽相连的、结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段的胞外区和跨膜区结构域；以及2)共刺激信号分子胞内结构域肽段；本发明的多基因重组嵌合抗原受体分子，具有完整表达、保持识别、结合功能的特异性，同时具有活化T细胞作用和生存能力延长功能。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种多基因重组嵌合抗原受体分子。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重威胁人类生命的疾病。恶性肿瘤或癌症的发病机理多种多样，其共同的表现在于变异的肿瘤细胞不受机体免疫系统的清除，能够无限制的繁殖和扩散，破坏周围组织的正常细胞和功能。长期以来，医药学界在尝试医治和控制肿瘤疾病的病程方面做了大量的努力，但收效甚微。目前，在恶性肿瘤的治疗上，除根除手术外，主流医学界的临床辅助治疗手段仍然是放射线治疗、化学药物治疗和抗体治疗。现有的治疗手段，对于肿瘤的复发几乎无效。

1985年，美国科学家尝试分离病人的单个核细胞，并在体外用各种细胞因子诱导、激活、产生杀伤性T细胞(Cytokine-induced killer cells，CIK)，继而发现这些细胞通过静脉滴注回输给病人后，对肿瘤的生长有杀伤作用。经过近三十年的临床应用和技术发展，用免疫杀伤细胞治疗肿瘤已经成为第四种公认的恶性肿瘤辅助治疗手段。常见的用于临床治疗的免疫杀伤细胞：自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK)、γδT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)、NK样T淋巴细胞(Natural killer-like Tcells，NKT)、Th1效应细胞(Effector cells)等。抗原提呈细胞之一树突状细胞(Dentriticcells，DC)也常用于免疫细胞治疗的应用，DC可以提高免疫杀伤细胞的特异性、加强免疫杀伤细胞的活力。

免疫活性细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤效果，取决于肿瘤细胞膜表面的受体分子表达。例如，γδT细胞、细胞毒性T淋巴细胞、Th1效应细胞等是通过T细胞受体(TCR)识别肿瘤细胞表达的组织相容性复合物(MHC)或白细胞抗原(HLA)结合的“抗原”肽片段序列而实施杀伤的；对于不表达MHC或HLA的肿瘤细胞无杀伤作用。而NKT、NK和γδT细胞的杀伤作用通过其他受体(CD1d、KAR等)结合机制，不依赖于肿瘤细胞MHC的表达。与大部分正常组织细胞相似，很多种肿瘤细胞并不表达或弱表达MHC分子，因此肿瘤细胞膜表面MHC分子表达的多样性是免疫细胞治疗疗效及临床应用推广受限的原因之一。

为了克服免疫杀伤细胞特异性低下的缺点，美国科学家发明一种转基因的方法：将识别肿瘤表面特异性抗原的单克隆抗体高变区序列在体外重组、亚克隆为单链抗体片段(Single chain antibody fragment of variable regions，scFv)，再与其他基因的跨膜蛋白片段和胞内信号肽融合形成人造的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，转染至T细胞内而形成嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor，CAR-T)。早期CAR-T的信号肽是CD3受体的Zeta亚基，后来发现嵌合CD28、CD137等蛋白的胞内信号肽后能加强Zeta的作用并显著延长CAR-T细胞的体内生存时间。临床研究结果表明，不同单抗制备的转基因CAR-T细胞对不同肿瘤有不同程度的疗效，明显高于非特异性的免疫杀伤细胞；其中“抗CD19单抗-CAR-T”细胞对急、慢性淋巴性白血病的疗效达到93％。这是恶性肿瘤治疗领域的一项重大突破。

CAR-T细胞在临床对其他实体瘤的治疗效果明显低于“抗CD19单抗-CAR-T”细胞对急、慢性淋巴性白血病的疗效。原因之一是淋巴性白血病癌细胞中95％都表达B细胞抗原CD19，而其他实体瘤细胞的特异性抗原表达在40-70％之间；所以在实体瘤的治疗中，单一的单抗CAR-T细胞不可能杀伤表达其他肿瘤特异性抗原的癌细胞。原因之二是免疫杀伤细胞通过血液/淋巴液循环浸润到实体肿瘤的速度和数目。原因之三是肿瘤组织细胞对免疫活性细胞的负调节作用。