[发明专利]一株低毒力重组猪脑心肌炎病毒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物动物疫苗技术领域，尤其涉及一株低毒力重组猪源脑心肌炎病毒,还涉及所述低毒力重组猪源脑心肌炎病毒的应用。

背景技术

脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus，EMCV)属于微RNA病毒科(Picornaviridae)成员。EMCV对啮齿类、猪、老虎、牛、大象、以及人在内的多种灵长类动物，致病性差异较大。某些EMCV分离株感染仔猪可引发急性致死性心肌炎，而感染母猪则会导致流产、死胎等繁殖障碍。该病毒已成世界性分布，阻碍了养殖业的发展，也对人类的健康造成影响。目前，全世界大概有40个毒株，从2005年至今，我国已分离到大约15个EMCV毒株，为该病毒深入研究提供丰富的材料。

EMCV为单股正链RNA病毒，全长为7.8kb，包括5’UTR、3’UTR和中间一个较大的开放阅读框(ORF)。该阅读框编码11个蛋白，包括4个结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4和7个非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D以及L蛋白。其中VP1的变异性最大，是EMCV重要的保护性抗原。随着RNA病毒全长cDNA感染性克隆技术的建立，研究者可以有效体外转录出感染性RNA，以拯救RNA病毒。目前，RNA病毒拯救系统至少有4种。先前报道的EMCV感染性克隆的构建都是将全长病毒的cDNA置于T7/SP6启动子的控制下，利用外源T7/SP6RNA聚合酶在体外转录RNA基因组，再转染易感细胞来拯救病毒，也有相关技术申请过专利。已有文献报道可以将体外转录过程转移到细胞体内进行，将病毒全长cDNA置于真核启动子CMV控制下，利用细胞内的RNA聚合酶I和RNA聚合酶II转录成RNA拯救病毒，该种方法产生的病毒量大约是前者的100倍。现有技术中，还没有使用此种方法拯救猪脑心肌炎病毒的报道。

发明内容

为了解决以上RNA病毒拯救中拯救猪脑心肌炎病毒方法方面存在的空白，本申请公开了一株低毒力猪源脑心肌炎病毒。

本申请还公开了上述一株低毒力猪源脑心肌炎病毒的应用。

本申请是通过以下措施实现的：

一株低毒力重组猪源脑心肌炎病毒，是通过以下步骤构建得到的：

(1)提取猪源脑心肌炎病毒株总RNA，RT-PCT扩增目的基因片段，扩增用引物如下

AF5-GCGTTAATTAAACCGTCTTGAAAGCCGGGGGTGGGAGATC-3

AR5-TCAGCTAGCAATGGAAGCATATTAG-3

B₁F5-GCGTTAATTAACATTGCTAGCTGATCAAAATACAGAAG-3

B₁R5-CACAAAGTCAGCAGTTGCGTCTGCGT-3

B₂F5-GAAAACGCAGACGCAACTGCTGACTTTGTG-3

B₂R5-TCTCTCGAGAGCACCCTGTGGCTCAAAG-3

CR₁5-TTCGGCTTGGGATTTAAATATGCATTTTTTTTTTTTTTT-3

CR₂5-CTCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGTAATTCGGCTTGGGATTT-3

以猪源脑心肌炎病毒总RNA作为模板，以AR、B₁R、B₂R、以及CR₁为特异性下游引物，构建反应体系获得的A、B₁、B₂、C片段的cDNA，分别以AF/AR，B₁F/B₁R，B₂F/B₂R，CF/CR₂为引物，相应的cDNA为模板进行PCR反应，获得A、B₁、B₂、C四个片段，然后利用B₁F/B₂R为引物，将B₁和B₂片段进行融合反应，获得B片段；

(2)将A、B、C片段分别与pEasy-simpleBlunt克隆载体进行连接，转化感受态细胞，培养，提取阳性重组质粒，分别得到重组质粒pEasy-A、pEasy-B和pEasy-C；