[发明专利]一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法

权利要求书

1.一种猪脂肪干细胞分离培养的方法，包括以下步骤：

1)将猪脂肪组织消化后进行细胞筛过滤，细胞筛过滤后进行梯度离心， 所述的细胞筛过滤和梯度离心重复两次，然后进行细胞培养，

所述消化采用LiberaseTL进行，所述消化的温度为37℃，时间为1～3h； 所述的LiberaseTL的浓度为15～25μg/mL，LiberaseTL与脂肪组织的体积比 为0.5～1∶1；

2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的脂肪组 织消化前还包括以下步骤：

采集猪脂肪组织；

将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液为含有 0.45～0.5g/L青霉素和0.6～1.0g/L链霉素的PBS溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪组织消化后还 包括终止消化，所述终止消化具体为：

使用含体积分数为7.5～15％FBS的低糖DMEM培养液终止消化，所述的 低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞筛过滤按照时 间顺序包括第一细胞筛过滤和第二细胞筛过滤；

所述第一细胞筛过滤中细胞筛的孔径为100μm，所述第二细胞筛过滤中 细胞筛的孔径为70μm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度离心按照时间 顺序包括第一离心和第二离心；

所述第一离心的转速为1000～1400rpm，所述第一离心的时间为8～12min；

所述第二离心的转速为8000～1200rpm，所述第二离心的时间为8～12min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传代培养采用的培养 液为含有体积分数为7.5～15％％FBS的低糖DMEM培养液，所述的低糖 DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。

7.一种猪脂肪干细胞的鉴定方法，包括以下步骤：

将猪脂肪干细胞进行生物学特性鉴定、表面抗原检测和诱导分化检测。

8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于所述生物学特性鉴定包 括测定生长曲线、测定细胞集落和分析细胞核型。

9.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于：所述脂肪干细胞表面 抗原检测前还包括：

将所述脂肪干细胞依次进行预消化和消化；

所述预消化采用LiberaseTL进行，所述LiberaseTL的浓度为 15～25μg/mL，所述预消化的时间为1～3min，所述预消化的温度为37℃，所述 预消化的环境中的CO₂的体积比例为5％，所述预消化的环境中的湿度为饱 和湿度；所述消化采用胰蛋白酶和EDTA进行，所述胰蛋白酶的质量浓度为 0.25％，所述EDTA的质量浓度为0.03～0.05％，所述消化的温度为37℃，CO₂饱和湿度为5％，所述消化的时间为1～3min。

10.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，所述的脂肪干细胞 诱导分化检测，包括以下步骤：

培养猪脂肪干细胞，当细胞汇合度达到80％-90％时，加入成脂诱导液、 成骨诱导液和成软骨诱导液进行为期2～4周的成脂、成骨和成软骨细胞诱导；

将诱导培养到期的细胞分别进行油红O、茜素红和阿尔新蓝染色；

将诱导培养到期的细胞进行成脂特异性基因Ppar-2、成骨特异性基因 Osteocalcin和成软骨特异性基因CollagenII检测；

所述的油红O、茜素红和阿尔新蓝染色和所述的成脂特异性基因Ppar-2、 成骨特异性基因Osteocalcin和成软骨特异性基因CollagenII检测之间无时间 顺序限定。