[发明专利]快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA试剂盒、试纸条RPA试剂盒及其用途

说明书

本发明公开了一种快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA试剂盒及其用途，还公开了一种快速检测猪伪狂犬病毒的试纸条RPA试剂盒及其用途。该两种试剂盒分别包括SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示的引物及各自的探针，虽然针对同一靶标序列，但引物和探针的修饰碱基和检测平台不同。实验证明本发明的两个试剂盒的敏感性均为10²拷贝/反应，并均只能特异性检测猪伪狂犬病毒。分别用本发明的两个试剂盒检测猪伪狂犬病毒疑似样品，结果表明这两个试剂盒的检测结果与qPCR的符合度均为100％。因此，本发明的两个试剂盒均能快捷、高效、灵敏的检测猪伪狂犬病毒，为猪伪狂犬病毒的鉴别诊断提供了有效技术手段。

技术领域

本发明涉及一种检测猪伪狂犬病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种基于RPA反应的用于快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA试剂盒以及试纸条RPA试剂盒，还涉及二者在快速检测猪伪狂犬病毒中的用途，本发明属于预防兽医学检验领域。

背景技术

自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。但是该技术需要特殊昂贵的热循环仪器以及熟练的操作人员，费时费力，难以用在现场诊断以及实验条件差的地方。在发展中国家实验室中，由于PCR实施所需要的基础设备和技术所限，大多数发展中国家仍然集中在使用传统的试验方法，比如血清学方法、显微镜技术，或者培养以及鉴定传染性以及非传染性疾病。为了填补传统方法和PCR之间的空缺，新的等温分子诊断技术正在开发，该方法尤其适用于基础设施、实验设备以及试验技术难于支持使用PCR进行诊断的地方。

与常规方法相比较，等温扩增实验具有很高的敏感性和特异性，这些原因促使不同的公司商业化不同的等温扩增技术，比如，环介导的扩增(LAMP；Eiken,日本)，RPA(RPA；Alere,USA and TwistDx,UK)，链置换扩增(strand displacement amplification,BectonDickson,USA)。在这些技术中，LAMP是使用最为广泛，且最成熟的试验方法。与RPA方法相比较，LAMP技术具有试验设计比较麻烦(3对引物)，特异性相对较弱(能扩增很多条带)，时间仍然相对较长，以及易于污染等不足的地方。

英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的核酸扩增产品能够在15分钟内，37℃-42℃之间进行核酸检测。现在使用最多的、最为成熟的为进行实时监控的体系(如exo试剂盒，real-time RPA)以及基于试纸条的终点检测(nfo试剂盒，Recombinase Polymerase Amplification Assaycombined with lateral flow test，LFS RPA)。

实时荧光RPA(real-time RPA)试验需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器，比如酶标仪或实时检测的热循环仪。自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业中，比如用于土拉弗朗西斯菌、细螺旋体、HIV-1DNA、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、天花病毒、B型链球菌、大肠杆菌产生的志贺毒素、中东呼吸综合征冠状病毒、裂谷热病毒、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、施马伦贝格病毒、牛病毒性腹泻病毒、黄热病毒以及戈登病毒等病原的检测。

对于试纸条RPA(LFS RPA)试验而言，只要温度能控制在37-42℃之间就行，比如可以在水浴锅等设置中进行反应，或者直接用人的体温进行加热，随后可以通过侧流层析试纸条LFS(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)读取试验结果。自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业中，比如用于感染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、恶性疟原虫、洋李痘疱病毒、羌虫、力克次体、隐孢子虫以及黄热病毒等的检测。与常规方法相比较，该实验具有很高的敏感性和特异性。