[发明专利]一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法

说明书

本发明公开一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，具有高生长速率的微藻隐甲藻ATCC 30556基因删除突变株的方法。其特征是包含如下步骤：(1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5‑二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco基因的克隆；(2)用于同源双交换整合的基因片段的构建；(3)Rubisco基因的删除和突变株的构建；(4)隐甲藻Rubisco基因删除突变体生长特性的比较分析。利用本发明的方法定点敲除隐甲藻的Rubisco基因，能够获得异养培养条件下具有高生长速率的隐甲藻突变株，为二十二碳六烯酸(DHA)高效发酵菌种的优化筛选提供了一种新方法。

技术领域

本发明涉及一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，特别是一种高生长速率的产二十二碳六烯酸(DHA)隐甲藻突变体的构建方法，具体是构建具有高生长速率的隐甲藻基因删除突变株的方法，属于工业微生物领域。

背景技术

二十二碳六烯酸DHA （docosahexaenoic acid）是n-3系多不饱和脂肪酸（n-3polyunsaturated fatty acid, n-3 PUFA）的一种。其含有6个不饱和键的特殊结构决定了它对人类健康有着特殊的作用和影响。人们对DHA的研究备受重视的另一个原因是发现DHA与生命现象密切相关，其在大脑的结构膜和视网膜中其中决定性的作用。

截止目前为止，深海鱼油一直是市售的DHA的主要来源。但这一主要来源存在诸多缺点，比如海洋污染造成的对鱼油安全性的担忧，鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同，含EPA、易受环境污染、纯化成本高，鱼油的特殊气味也限制了鱼油来源的DHA作为一种食品添加剂的应用。尤其是考虑到DHA的主要消费者是怀孕妇女和年幼的孩子，其可能的不利影响更令人担忧；此外，世界渔业资源的逐年萎缩对DHA的可持续性供应的影响也值得考虑。

利用隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）发酵生产DHA，与传统鱼油来源相比，具有一系列优点，如发酵周期短，培养方式简单，微生物生长快，易于大规模培养；多不饱和脂肪酸含量高，产品质量稳定，氧化稳定性较好，不饱和脂肪酸成分单一，不含EPA或EPA含量低，易于分离纯化；同时克服了传统的从鱼油中获取DHA受原料、气候、产地、生产周期等诸多限制因素的影响。因此微生物发酵生产DHA可替代鱼油来源的DHA，具有广泛的应用前景。

异养微藻隐甲藻因其能在体内大量积累油脂（其中DHA的含量达到40%-50%）而受到研究人员的特别关注。然而有关隐甲藻基因工程相关的研究工作一直处于延至状态，究其原因主要是隐甲藻细胞基因转化体系和突变体构建技术一直没有突破性进展。因此，研究人员很难从基因层面全面了解隐甲藻油脂积累的代谢过程，这也进一步阻碍了人们通过基因工程技术手段修饰隐甲藻底盘细胞进一步提高其在发酵领域的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种隐甲藻突变体的构建方法。

本发明一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法是通过下列方式完成，其包含如下步骤：

1） 隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco的克隆：

采用隐甲藻的Rubisco序列（EB086308.1）设计上游引物和下游引物，以隐甲藻的cDNA为模板进行PCR，纯化目的片段，连入pTZ57R/T载体（Thermo Fisher Scientific）并测序；

2）用于同源双交换整合的基因片段的构建：

① 隐甲藻Rubisco基因上游片段的扩增：