[发明专利]病毒载体颗粒及其构建方法和应用有效
| 申请号： | 201610077434.0 | 申请日： | 2016-02-04 |
| 公开（公告）号： | CN105567739B | 公开（公告）日： | 2019-07-12 |
| 发明（设计）人： | 孟疆辉;刚轶金;孟宝玺 | 申请（专利权）人： | 郑州可尔利尔生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/861;C12N15/864;C12N15/869;A61K45/06;A61P29/00;A61P19/02 |
| 代理公司： | 河南科技通律师事务所 41123 | 代理人： | 韩松;张晓辉 |
| 地址： | 450016 河南省郑州市郑州经济技术开*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 病毒 载体 颗粒 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种病毒载体颗粒，包括pspax2、pmd2.G和pwpi质粒，其特征在于：所述pwpi质粒包含启动子、肉毒素D型酶活区以及内部核糖体进入位点序列；所述肉毒素D型酶活区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，所述肉毒素D型酶活区序列的起始编码序列之前插入有增强表达序列ACCATGGGC；所述病毒为慢病毒。
2.权利要求1所述病毒载体颗粒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将细胞系 lenti-x293T的细胞密度培养至70%；
（2）洗去培养液中的血清，换成无血清的DMEM培养基；
（3）将权利要求1中所述pspax2、pmd2.G和pwpi质粒用磷酸钙转染法转染到lenti-x293T细胞中；
（4）四小时后，洗掉转染液，加入含10wt%小牛血清的培养液进行培养；
（5）回收培养液，将细胞碎片过滤，再进行超速离心，即可获得高滴度的病毒载体颗粒。
3.根据权利要求2所述的病毒载体颗粒的构建方法，其特征在于：步骤（3）所述pwpi、pmd2.G和pspax2的转染用量比例为2：1：10。
4.根据权利要求2所述的病毒载体颗粒的构建方法，其特征在于：步骤（3）所述转染法具体包括以下步骤：
①在10mL的Falcon管A中加入288μL 2mol/L的 CaCl2溶液，以及pwpi质粒10μg、 pmd2.G质粒5μg和pspax2质粒100μg，补水到2880μL的总体积；
②在10mL的Falcon管B中加入2880μL的2xHBS buffer，再将Falcon管A中液体滴入Falcon管B，在2～3秒内迅速混合均匀；
③将所得混合液在室温下放置15～20分钟，再滴入长有lenti-x293T细胞的直径为15cm的培养皿中。
5.根据权利要求2所述的病毒载体颗粒的构建方法，其特征在于：将所述细胞碎片通过0.45μm过滤器进行过滤；所述超速离心的转速为30000rpm，时间为2h。
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