[发明专利]一种vWF活性保护液

说明书

技术领域

本发明涉及一种从人血浆冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人血管性血友病因子的制 备工艺，特别涉及一种vWF活性保护液，属于生物制药领域。

背景技术

vWF是一种具有多聚体的血浆糖蛋白，其分子量从250kDa到2千万kDa不等，形成血 浆中已知的最大分子量可溶性蛋白。血浆中小分子量vWF主要是二聚体形式，分子量约 500kDa。大小不等的多聚体，对维持vWF正常生物活性具有重要意义。

血浆vWF在原发性止血中起着重要作用，其负责血小板与受损伤血管表面的粘附，并因 此形成血小板栓子，有助于纤维蛋白交联的形成。另外，血浆vWF起着凝血因子VIII的运 输剂和稳定剂的作用。

血管性血友病(vWD)是最常见的遗传性出血性疾病，患者vonWillebrand因子(von Willebrandfactor，vWF)基因突变或调控异常导致血浆vWF数量减少或质量异常。vWD临 床特征主要为皮肤黏膜出血，2N型和3型患者还可发生与血友病A相似的关节腔出血和肌 肉血肿。据国外报道，vWD发病率(2.3～11.0)/10万人口，一般认为在遗传性出血性疾病 中，vWD居第二位。

临床上vWF的活性用瑞斯托霉素辅因子活性(vWF:RCo)来表征，主要用于治疗先天性、 获得性血管性血友病(vWD)，一般以20～60UvWF:RCo/kg剂量来给药。

研究表明冷沉淀中富含vWF等凝血因子类物质。在血浆原料日趋紧缺的今天，通过冷沉 淀来制备vWF，对冷沉淀的综合利用，节约稀缺血浆资源，提高市场竞争力具有重大意义。

现有技术中，较早的工艺使用vWF的抗体偶联到琼脂糖凝胶上，通过免疫亲和层析纯化 vWF，但其抗体制备周期长，凝胶载量低，不适合作大规模制备，如《Purificationofvon WillebrandFactorsolutionsusinggelpermeationchromatography》(UP4774323)。

有专利用DEAEFractogelTSK650M(Merck)纯化vWF因子组分，纯度高，但是工艺 比较复杂，需要两步离子交换和一步亲和层析，如《Processforanindustrial-scalepreparationof astandardizedhumanvonWillebrandfactorconcentrateofveryhighpurityandsuitablefor therapeuticuse》(US5408039)。也有报道CHT层析结合PH5.4酸沉淀分离vWF组分的， 其比活不高，且酸沉淀去除纤维结合蛋白的同时，可能影响vWF的生物学活性，如《Production ofavonwillebrandfactorprepartionhavingagreatspecificactivity》(US20070135619A1)。

另外还有一些工艺用EMDFractogelTMAE(Merck)来纯化VIII/vWF因子复合物，但 是都无法单独得到高纯度的vWF，治疗针对性不强，如《具有止血活性的含有vWF的制剂 及其制备方法》(CN1425024A)，《AProcessforrecoveringahigh-purityvirus-inactivatedfactor VIIIbyanionexchangerchromatography》(US5714590)。

还有一些公司用基因重组的方法(猴肾细胞或CHO细胞)纯化vWF，他们通过阴离子 交换层析法从动物细胞培养液中进行提纯，但是由于动物原性抗原的存在，人体对其可能有 排斥作用，如《MethodforisolationofhighlypurevonWillebrandFactor》(US5854403)。

另有采用两步层析法纯化制备vWF的报道，但其纯度不高，比活相对较低，仅50IU/mg， 如《ProcessformanufacturingvonWillebrandfactor》(US5252710)。

可见，现有的的vWF纯化工艺仍存在一些问题：(1)制备周期长，不适应于大规模制 备，尤其是采用免疫亲和层析法纯化时，其抗体制备周期长，凝胶载量低。(2)VIII/vWF 复合物产品在较难控制工艺稳定性；(3)重组方法所得vWF产品可能存在异质抗原；(4) 分离纯化工艺繁琐。