[发明专利]经血源宫内膜干细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞领域，特别涉及经血源宫内膜干细胞的分离培养方法。

背景技术

子宫是一个具有高度再生及分化能力的组织，每个月经周期，女性的子 宫内膜可以从0.5mm左右增长到5～7mm左右，一个女性一生可以经历400次这 样的循环。研究表明，子宫内膜中含有干细胞，具有高度的分化潜能，增殖 能力以及较低的免疫源性。但是其直接获得途径，包括子宫切除术、早期妊 娠脱膜、刮除术均对供者具有严重侵入性。

近年来，日本科学家在女性经血中发现了具有多向分化潜能的干细胞， 该干细胞可用于修复受损的心肌组织。2008年，美国科学家Patel等发现，从 健康女性经血中可分离出来间充质干细胞，这些细胞具有多向分化能力，并 将该细胞命名为经血源子宫内膜干细胞(menstrualblood-derivedmesenchymal stemcells，MenSCs)。MenSCs属于成体干细胞的一种，具有来源丰富、有效 成分含量丰富、收集过程无创、增殖和分化潜能巨大、无伦理争论及废物回 收利用等优点。同时，研究表明，宫内膜干细胞可以用于治疗卵巢早衰、子 宫内膜疾病、预防衰老等功能，有望成为较为理想的种子细胞。

目前，对于宫内膜干细胞的分离培养，多采用直接获得途径，对患者造 成很大的伤害，同时来源苦难以及受伦理限制等问题；经血源干细胞虽有少 量研究，但是其无简单方便的方法采集经血，导致经血受污染几率较高，获 得的干细胞数量较少，纯度较低，分化潜能较低，同时成本较高、过程复杂 等。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种经血源宫内膜干细胞的分离培养方法。本发 明利用经血保存液、隔层离心管和细胞贴壁相结合的方法，达到高效分离培 养经血源宫内膜干细胞的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了经血源宫内膜干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：

步骤1：获得经血；

步骤2：取所述经血稀释后获得经血稀释液，与分离液混合、离心；

步骤3：收集上清液清洗后，再与培养基混合，离心；

步骤4：收集沉淀，接种，培养。

在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法步骤2中所述稀释为 经PBS溶液按照体积比1∶1的比例稀释；

步骤2中所述分离液为Ficoll分离液，所述经血稀释液与所述分离液的体 积比为1∶(0.5～1)；

步骤2中所述离心为于700～800g离心15～30min。

在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法步骤3中所述清洗为 用PBS清洗2～4次；

步骤3中所述培养基为无血清培养基。

在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法步骤4中所述接种的 密度为(7～8)×10⁵/ml。

在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法步骤4中所述培养为 48h后半量换液，72h后全量换液，之后每3d换液1次，7～14d在显微镜下观 察到克隆的形成，当细胞生长至70～80％汇合时，胰蛋白酶消化。

在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法所述胰蛋白酶消化为 弃去培养基，清洗，加质量浓度为0.3～0.5％(w/w)的胰蛋白酶消化，传代。

在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法所述消化的时间为2～ 3min，终止消化，离心，用无血清培养基重悬细胞沉淀。

在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法所述终止消化采用细 胞体积3-5倍量的含5％FBS的培养基；

所述离心为1000rpm离心5min。

在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法步骤1中获得的经血 采用经血保存液保存；所述经血保存液包括(2-5)×青霉素、(2-5)×链霉素、 30～50μg/ml卡那霉素、30～50μg/ml枸橼酸钠、100U/ml肝素钠的磷酸盐缓冲 液。

在本发明的一些具体实方案中，所述分离培养方法步骤2所述与分离液 混合和/或步骤3中所述清洗采用隔层离心管。

本发明提供了经血源宫内膜干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：获 得经血；取所述经血稀释后获得经血稀释液，与分离液混合、离心；收集上 清液清洗后，再与培养基混合，离心；收集沉淀，接种，培养。