[发明专利]一个参与DMNT和TMTT生物合成的CYP450基因及其编码产物与应用

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，特别涉及DMNT和TMTT化合物合成相关的蛋白，编码 其的基因及其应用。

背景技术

在植物的众多化合物中，有一些是挥发性物质。植物挥发物在植物抵御虫害的过程中发 挥着重要的作用。当植物受到害虫的危害之后，植物会感知到，并通过合成释放挥发性物质 来趋避害虫或引诱植食性昆虫的天敌来减轻害虫危害，从而提高植物的抗虫性。萜烯类挥发 物包括单萜类，倍半萜类，二萜类和萜烯同系物(E)-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯((E)-4， 8-dimethyl-1，3，7-nonatriene，DMNT)和(E，E)-4，8，12-三甲基-1，3，7，11-十三 碳四烯((E，E)-4，8，12-trimethyltrideca-1，3，7，11-tetraene，TMTT)等。DMNT和 TMTT是植物花香挥发物和害虫诱导挥发物中最常见的一类，这两种物质在单子叶植物和双子 叶植物中广泛存在，包括杨树和胡桃树等树种，还有玉米、拟南芥、棉花、利马豆、黄瓜、 番茄和大白菜等作物。DMNT和TMTT在生态系统能吸引多种害虫的寄生性天敌和捕食性天敌， 如智利小植绥螨、微红盘绒茧蜂和盔奥啮小蜂等。此外，DMNT和TMTT能诱导或预警未被危害 的邻近植物或同一植物内的防御反应。

DMNT和TMTT的前体分别为(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇。但是，把橙花叔醇和香 叶基芳樟醇转化为DMNT和TMTT的关键酶很久都未解决。氘标记的代谢物探针研究表明叔醇通 过碳碳骨架沟的氧化反应而形成萜烯同系物。通过拟南芥的共表达数据库鉴定出一批在多种 压力胁迫下与香叶基芳樟醇合成酶基因共表达的P450基因，该方法结合对诱导处理叶片的 RT-PCR研究，鉴定到一个候选的P450基因。通过酵母表达和对拟南芥突变体株系的回补实验 研究，发现植物的CYP82家族成员CYP82G1(At3g25180)负责着拟南芥TMTT的合成。

CYP450酶为血红蛋白结合蛋白，在所有已知的CYP450酶中都存在一个保守的血红素结合 域，是鉴定该基因的一个重要特征。拟南芥基因组中有272个CYP450基因，拟南芥基因组注释 显示有457个CYP450基因，如此庞大的基因家族反映了植物次生代谢物的复杂多变。各种 CYP450酶催化的反应广泛并且复杂，包括羟基化、N-、0-和S-端的脱烷基化、环氧基化、脱 氨基作用、脱硫、脱卤作用和过氧化反应等。尽管催化反应各异，催化机理却相同，即通过 NADPH或者NADH为CYP450传递电子，激活氧分子，将其中的一个氧插入到底物上，同时生成一 分子水。CYP450酶作为萜类、黄酮类、脂肪酸类和植物激素等合成代谢途径的一类重要酶蛋 白，不但催化相关代谢反应，由于大多数的CYP450蛋白均有一段内质网膜定位蛋白，因此在 代谢区室(Metabolon)的酶复合体中还具有固定酶复合体的作用。随着分子生物学以及相关检 测技术的不断发展，次生代谢途径相关的CYP450基因功能逐渐得以验证。真核表达、原核表 达以及RNA干扰(RNAInterference)等技术在CYP450基因的功能验证中发挥了重要作用。近年 来利用真核表达使得CYP450酶在紫杉酚、青蒿素、植物挥发物等代谢途径中的重要作用逐渐 被解析。但是作为在植物次生代谢中发挥作用的CYP450表达量相对较低，并且大多CYP450蛋 白具有严格的催化底物结构特异性，同时基因组中广泛存在的CYP450基因为次生代谢相关基 因的克隆和功能验证提供了难度，使之成为了近年来国际学术界的研究热点之一。

到目前为止DMNT和TMTT合成通路只有在拟南芥中被解析。在其他物种中的研究尚停留在 化合物鉴定和行为学研究方面，尚未有DMNT和TMTT合成通路基因被报道。特别是在农业生产 中重要的植物，如蔬菜和农作物等方面的研究更为有限，这限制了我们对于DMNT和TMTT合成 通路的认识，也限制了DMNT和TMTT在绿色农业生产中的应用。这极大的限制了DMNT和TMTT在 农作物中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一个立马豆DMNT和TMTT生物合成代谢途径的CYP450基因 PlCYP82，其编码的蛋白在含有NADPH的缓冲体系中能催化(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟 醇生成DMNT和TMTT。