[发明专利]马氏珠母贝抗菌肽PmAMP及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及马氏珠母贝抗菌肽PmAMP及其应用。

背景技术

抗菌肽是一种天然的多肽，它不会像抗生素那样产生耐药性，而且在很多海洋生 物中都存在。当一些传统的抗生素被禁止使用之后，很多学者转向了抗菌肽的研究，并取得 了一系列的成果。抗菌肽能够提高植物抗病能力，人们将一些抗菌肽的基因导入到植物中， 让植物具有抵抗某些病害的作用，在食品中，一些添加剂会给人们的身体造成危害，将抗菌 肽应用到食品防腐保鲜剂能够有效的杀死一些霉腐微生物而且对人体不带来伤害。凌斌勋 等发现柞蚕抗菌肽具有抗瘤效果。对于水产养殖中的应用也十分重要，水环境中是微生物 生长比较密集的地方，因此抗菌肽是鱼、虾、贝最有效的防御病害的免疫因子。目前对海洋 生物抗菌肽的研究多集中在双壳贝类和甲壳类等低等生物。其中双壳贝类抗菌肽分子的研 究又多集中在贻贝属都取得了相应的成果。

马氏珠母贝属于双壳贝类，缺乏特异性免疫系统，防御系统完全靠细胞免疫和体 液免疫因子。近年来因沿海水质的日趋恶化，各种病害也频繁发生，致使马氏珠母贝因病害 发生大量死亡，对我国珍珠产业带来严重的经济损失，提高马氏珠母贝抗胁迫能力是目前 亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种马氏珠母贝抗菌肽PmAMP。

本发明的另一个目的是提供一种马氏珠母贝抗菌肽PmAMP基因。

本发明的另一个目的是提供马氏珠母贝抗菌肽PmAMP的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种马氏珠母贝抗菌肽PmAMP，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

本发明利用高效液相色谱从马氏珠母贝血清中分离得到一种未知的具有抑菌活 性的蛋白成分。通过质谱测序得到部分氨基酸序列，将该序列在马氏珠母贝蛋白库中搜索， 得到一条与其相匹配的蛋白序列，找到与它相对应的基因序列，以之为模板克隆得到cDNA 全长。在NCBI上比对，没有找到与它相匹配的蛋白，以在线SMART程序，发现它没有结构域， 初步认为它是一种新的蛋白。命名为PmAMP（PinctadamartensiiAntimicrobial peptide）。

通过RACE的方法，获得编码抗菌肽PmAMP的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：2或 SEQIDNO：3所示；氏珠母贝抗菌肽（PmAMP）基因cDNA全长为700bp，包括了156bp的5'UTR和 250bp的3'UTR，其中开放阅读框为294bp，编码了97个AA。

研究发现所获得马氏珠母贝PmAMP能明显抑制大肠杆菌和藤黄微球菌的生长，因 此，本发明还提供1所述马氏珠母贝抗菌肽PmAMP在抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长中的用 途。

另外，本发明还设计了一对检测所获得马氏珠母贝PmAMP基因的荧光定量引物，用 于分析马氏珠母贝PmAMP基因在各组织中的表达情况，因此本发明还保护一对检测所述马 氏珠母贝抗菌肽PmAMP基因的荧光定量引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：4~5所示。

本发明还提供包含SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所述马氏珠母贝抗菌肽PmAMP基因 的重组载体；同样还提供含有权利要求5所述重组载体的重组菌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以马氏珠母贝为研究对象，运用高效液相色谱仪对其血清进行分离纯化，筛选 出具有抑菌活性的蛋白，所获得马氏珠母贝PmAMP能明显抑制大肠杆菌和藤黄微球菌的生 长，通过质谱测序，采用RACE技术克隆cDNA全长，获得编码抗菌肽PmAMP的基因，其核苷酸序 列如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示；氏珠母贝抗菌肽（PmAMP）基因cDNA全长为700bp，包 括了156bp的5'UTR和250bp的3'UTR，其中开放阅读框为294bp，编码了97个AA。

应用荧光定量PCR检测PmAMP在组织中的表达含量，发现闭壳肌中表达含量最高， 而在血液中表达含量较低，用细菌刺激之后，发现8h在血细胞中含量最高，有显著差异性， 表明了PmAMP是一种免疫蛋白，本研究为马氏珠母贝的免疫研究和马氏珠母贝病害防治提 供了新的资料。

附图说明

图1为马氏珠母贝血清分离组分对藤黄微球菌和大肠杆菌生长抑制图。