[发明专利]一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1. 一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2. 如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，编码所述重组蛋白的核苷酸序列为SEQID NO:8。

3.如权利要求1或2所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

1）通过PCR扩增Mhp168菌株mhp107基因的第1666~3099位的核苷酸序列，所述的PCR扩增的引物为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；

2）将步骤1）得到的核苷酸序列中的第627位的A突变为G，得到重组蛋白Mhp107-C的编码序列；

3）将步骤2）得到的重组蛋白Mhp107-C的编码序列连接到骨架质粒上，得到表达载体；

4）将步骤3）得到的表达载体转化到宿主菌中诱导表达后，经提取纯化即得到重组蛋白Mhp107-C。

4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述PCR的反应条件为：98ºC预变性5 min；98ºC变性1 min，50ºC退火1 min，72ºC延伸1min 40 s，30 cycles；72ºC 延伸6min。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2）是通过包括下述步骤的方法实现的：

a）将步骤1）得到的核苷酸序列连接到pMD^TM19-T载体，得到pMD^TM19-mhp107-C重组质粒，转化宿主菌大肠杆菌DH5α，培养；

b）提取pMD^TM19-mhp107-C重组质粒，并以所述pMD^TM19-mhp107-C重组质粒为模板，以SEQID NO:6和SEQ ID NO:7为引物进行PCR，得到突变后的重组蛋白Mhp107-C的编码序列mhp107-CM；

c）将上述PCR产物经DpnI消化、胶回收后，转化宿主菌培养后，提取质粒，选取经鉴定序列正确的载体即为pMD^TM19-Mhp107-CM载体；

d）将步骤c）得到的pMD^TM19-Mhp107-CM载体以BamHI和NotI双酶切得到重组蛋白Mhp107-C的编码序列。

6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤a）中，所述步骤1）得到的核苷酸序列与pMD19^TM-T载体的摩尔比为3:1，连接反应体系如下：mhp107-C 4.5μL，pMD^TM19-T载体0.5μL，Solution I 5μL，16℃连接1h。

7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤b）中，所述PCR的反应条件为：98ºC预变性5 min； 98ºC 变性1 min 30 s， 60ºC退火1 min 30 s，72℃延伸4 min 30 s，20cycles；72ºC延伸10 min。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述骨架质粒为pGEX-6P-2。

9. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4）中所述纯化是通过谷胱甘肽琼脂糖珠和PreScission Protease 酶实现的。

10.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含由骨架质粒可修饰地连接编码如权利要求1或2所述的重组蛋白的核苷酸序列形成。

11.如权利要求10所述的载体，其特征在于，所述骨架质粒为pGEX-6P-2。