[发明专利]牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用

说明书

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用。本发明所述试剂盒中包括牛布鲁氏菌检测引物及探针、羊布鲁氏菌检测引物及探针、猪布鲁氏菌检测引物及探针、犬布鲁氏菌检测引物及探针，所述试剂盒检测灵敏度高，最低检出限为1×10³copy/ml，准确率及阳性率均高达100%。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用。

背景技术

布鲁氏菌是革兰氏阴性，无芽孢兼性细胞内寄生的细菌，是引起人畜共患传染病布病的病原体。家畜感染后能引起母畜流产，公畜睾丸炎，导致患病家畜繁殖能力和生产性能下降，并影响畜产品的质量和安全，可造成严重经济损失；人感染后能引起波浪热、关节炎以及睾丸炎、附睾炎，孕妇可引起流产等，严重者可丧失劳动能力。严重影响我国畜牧业发展和人类健康。

布鲁氏菌的主要宿主为牛羊猪犬等家畜和野生动物，也存在于海洋动物中。通过刀伤、擦伤、口腔粘膜、鼻腔、眼结膜、生殖道，甚至未损伤的皮肤等途径而感染。人的感染几乎都是由于接触感染动物所致，人和人之间的传播罕见(母乳感染婴儿除外)。

布鲁氏菌属目前分为10个种，包括牛种(B.abortus)、羊种(B.melitensis)、猪种(B.suis)、犬种(B.canis)、绵羊附睾种(B.ovis)、沙漠森林野鼠种(B.neotomae)、田鼠种(B.microti)、B.ceti(分离自鲸鱼和海豚)、B.pinnipedialis(分离自鳍足类)、和B.inopinata(分离自病人)。

每年由于牛羊流产给养殖业造成了巨大的经济损失，猪和犬感染也比较常见，这些动物与人类关系密切，容易导致人换布鲁氏病。

目前用于布鲁氏菌分型的方法很多，有限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、Rep-PCR和ERIC-PCR、rpoB基因多态性、多位点测序分型(MLST)及测序法等。但没有统一的标准，很多方法都存在实验过程比较繁琐、耗时，且多数方法都有一部分非典型株用现有方法无法分型。严重影响了布病的流行病学调查和疫病预防。

基于荧光定量PCR法联合检测布鲁氏菌羊种、猪种、犬种和牛种布鲁氏菌试剂盒能够快速诊断出哪种布鲁氏菌感染，更简便快捷准确地对布鲁氏菌属进行分型。有利于分子流行病学调查、病原菌的溯源及分析菌株间的差异关系。

发明内容

针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种牛羊猪犬布鲁氏菌分型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括牛布鲁氏菌检测引物及探针、羊布鲁氏菌检测引物及探针、猪布鲁氏菌检测引物及探针、犬布鲁氏菌检测引物及探针，所述牛布鲁氏菌检测引物包括核苷酸序列如SEQID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物，牛布鲁氏菌检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述羊布鲁氏菌检测引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物，所述羊布鲁氏菌检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述猪布鲁氏菌检测引物包括核苷酸序列如SEQID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物，所述猪布鲁氏菌检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述犬布鲁氏菌检测引物包括核苷酸序列如SEQID NO.10所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的下游引物，所述犬布鲁氏菌检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述牛布鲁氏菌检测探针、羊布鲁氏菌检测探针、猪布鲁氏菌检测探针、犬布鲁氏菌检测探针标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。