[发明专利]利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法及应用方法

权利要求书

1.一种利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，包括以下步骤：

从新鲜牛眼球上切取角膜片后，并将角膜片浸泡在低渗溶液中；

由角膜片上得到包含前弹力层和部分基质层的牛角膜基质，将其反复冻 融，以使细胞破碎；

依次采用缓冲液对牛角膜基质进行漂洗、以及将其放入脱细胞试剂中进 行浸泡后，采用超纯水对其进行冲洗；

将牛角膜基质放入另一种脱细胞试剂中进行浸泡后，再次采用超纯水对 牛角膜基质进行冲洗；

将牛角膜基质放入脱水剂中进行浸泡后，采用钴-60对牛角膜基质进行辐 照后，将所制备的牛角膜基质放干燥保存。

2.根据权利要求1所述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其 特征在于，上述方法的具体步骤如下：

S1、取12小时内的新鲜牛眼球，用生理盐水冲洗干净后，用显微角膜环 钻切取200～500微米的角膜片，将其放于低渗溶液中浸泡30～60分钟；

S2、用手术刀刮掉角膜片的上皮层，保留前弹力层，撕掉后弹力层和内 皮层，得到包含前弹力层和部分基质层的牛角膜基质，将其反复冻融使细胞 破碎；

S3、依次采用缓冲液对牛角膜基质漂洗2～3次、以将其放入脱细胞试剂 浸泡15～90分钟，再采用超纯水对其进行冲洗2～3次；

S4、将牛角膜基质放入另一种脱细胞试剂浸泡15～30分钟后，再采用超 纯水对其进行冲洗2次；

S5、将牛角膜基质放入脱水剂中进行浸泡3～6小时后，采用剂量为 5～15KGy的钴-60对牛角膜基质辐照1～5小时后，将所制备的牛角膜基质放置 于无水氯化钙中干燥保存。

3.根据权利要求2所述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其 特征在于，在步骤S1中，低渗溶液为浓度为0.3％～0.5％的NaCl溶液。

4.根据权利要求2所述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其 特征在于，在步骤S2中，将牛角膜基质冷冻1或3小时，并解冻15～60分钟， 以使牛角膜基质的细胞破碎。

5.根据权利要求2所述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其 特征在于，在步骤S3中，缓冲液为100mmTris-HCl缓冲液，其pH值为7.5；

脱细胞试剂采用浓度为3-5g/L的碳酸氢钠溶液。

6.根据权利要求2所述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其 特征在于，在步骤S4中，另一种脱细胞试剂采用浓度为0.6‰～1.8‰的次氯酸 钠溶液。

7.根据权利要求2所述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其 特征在于，在步骤S5中，脱水剂采用体积比为70％或80％的甘油脱水剂。

8.根据权利要求2或7所述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法， 其特征在于，在步骤S5中，将牛角膜基质放于质量指标符合HG/T2765-2005 标准的硅胶干燥剂中干燥保存。

9.一种利用新鲜牛角膜以制备的牛角膜基质的应用方法，其特征在于， 该牛角膜基质采用权利要求1或2所述的制备方法制备而成，在对其应用前 采用PBS浸泡10分钟复水后，即可在手术中使用。