[发明专利]一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法

权利要求书

1.一种同时、批量检测微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将微生物培养液离心、取上清液；

(2)将一部分步骤(1)所述上清液90-100℃加热1-3分钟，得经过热处理的上清液，剩余的步骤(1)所述上清液为未经过热处理的上清液；

(3)将步骤(2)中所述经过与未经过热处理的上清液与反应缓冲液按体积比1∶0.5-1∶2分别混合，所述反应缓冲液的组分为2-4.5g/L偶氮酪蛋白、25-45mM吗啉丙磺酸和1.5-3mM氯化钙，35-45℃反应2-3小时，加入1.5-3M三氯乙酸溶液或三氟乙酸终止反应，离心，取上清转移至多孔板，向所述上清中加入强碱溶液至强碱终浓度为0.2-0.5M，分别检测450nm吸光值；

(4)将步骤(3)所得450nm吸光值分别换算为步骤(2)所述经过热处理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性，所述换算的方法为将样品在450nm处的吸光值减去空白对照在450nm的吸光值得吸光值增值，再将所述吸光值增值换算为每毫升样品每小时的吸光值增值即得所述胞外蛋白酶酪蛋白水解活性；所述胞外蛋白酶的耐热性为所得经过热处理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性的比值。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中，所述微生物培养液通过包括以下步骤的方法获得：

1)将微生物接种于复壮培养基中30℃培养24h，得复壮培养液；

2)将步骤1)所述复壮培养液转接至灭菌脱脂乳，30℃继续培养48h，即得。

3.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)中，所述复壮培养基为MPC培养基，所述MPC培养基的组分为5.0g/L胰化蛋白胨、2.5g/L酵母提取物和1.0g/L葡萄糖；和/或，步骤1)中所述培养为振荡培养；和/或，步骤2)中，所述灭菌脱脂乳为灭菌脱脂复原乳；和/或，所述转接的比例为体积比1∶10；和/或，步骤2)中所述培养为振荡培养。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中，所述加热的温度为95-100℃；和/或，所述加热的时间较佳地为2-3分钟；和/或，所述加热为水浴或金属浴加热；和/或，所述一部分为1/2。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中，所述经过与未经过热处理的上清液与反应缓冲液按体积比1∶1混合。

6.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中，所述偶氮酪蛋白的浓度为3-4.5克/升；和/或，所述吗啉丙磺酸的浓度为35-45mM；和/或，所述氯化钙的浓度为1.5-2mM。

7.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中，所述反应的温度为40℃；和/或，所述反应为2小时。

8.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中，所述三氯乙酸或三氟乙酸的浓度为2M；和/或，所述三氯乙酸溶液或三氟乙酸溶液的体积占反应体系总体积的1/10；和/或，所述强碱的终浓度为0.2M。

9.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中，所述强碱为氢氧化钠或氢氧化钾；和/或，所述强碱溶液的浓度为1M；和/或，所述离心的转速为10000转/分钟；和/或，所述离心的时间为15分钟；和/或，所述离心的温度为25℃；和/或，所述多孔板为96孔板；和/或，检测所述450nm处的吸收值将样品批量置于所述多孔板中用酶标仪进行检测。

10.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)中，所述空白对照为去离子水。