[发明专利]一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表达载体及胰岛素样生长因子 结合蛋白3的表达方法。

背景技术

身材矮小(shortstature)是指在相似环境下,儿童身高低于同种族个体正 常身高2个标准差以上，或者低于正常儿童生长曲线第三百分位。在众多因素 中，内分泌的生长激素(GH)对身高的影响起着十分重要的作用。患儿因GH缺 乏所导致的矮小，称为生长激素缺乏症，又称为垂体性侏儒症。

IGF-1是一种具有广泛作用的生长激素依赖性细胞因子，对成骨细胞有促 进有丝分裂的作用，还可刺激成骨细胞的AKP活性促进骨钙素的合成，对成 骨细胞其它分化功能亦有影响。IGF-1在一些患侏儒症、生长激素缺乏症、矮 小症等的儿童中，比正常对照组儿童会明显减少。胰岛素样生长因子结合蛋 白3(IGFBP-3)是血液中IGF-1的主要载体，它结合了血清中大部分游离的 IGF-1，当IGFBP-3与IGF-1结合后,可以减少游离IGF-1的浓度，有利于增强和 发挥IGF-1受体的活性，可以延长IGF-1的半衰期,提高血清中的水平。

科学研究发现GH缺乏或不足会影响循环中的IGF-1和IGFBP-3含量；反 之，血液IGF-1和IGFBP-3水平也反映了内源性的生长激素的分泌情况，而且 数值稳定，几乎没有昼夜变化，所以，检测GH、IGF-1和IGFBP-3能较好反映 机体GH的分泌情况，对临床早期诊断矮小症和GH分泌减低患儿有较重要意 义。

开发IGFBP-3检测试剂，特别是以ELISA法检测IGFBP-3含量，最重要的 环节是IGFBP-3抗体的制备，而决定抗体免疫原性的重要因素就是抗原。含量 高、纯度好的抗原为抗体免疫原性的提高提供了保障。因此，开发产物得率 高、纯度好的IGFBP-3的表达方法是十分必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种表达载体胰岛素样生 长因子结合蛋白3(IGFBP-3)的表达方法。以本发明提供方法制备IGFBP-3 得率高，所得产物纯度良好。

本发明提供了一种表达载体，包括IGFBP-3基因和TEV基因。

作为优选，表达载体的骨架为pUC57-simple。

TEVProtease是来源于烟草蚀纹病毒(TEV)的蛋白酶经改进后的50kDa的 蛋白酶，经过设计后与天然TEV蛋白酶相比其稳定性更好。本发明将该TEV 基因与IGFBP-3基因共同连接入表达载体，经表达产生融合蛋白后，以TEV 为亲和标签进行纯化后再以TEV蛋白酶将融合蛋白中的TEV部分去除，从而 获得纯度更好的IGFBP-3蛋白。

本发明采用的IGFBP-3基因来自Genbank，登录号为3486，其制备采用 人工合成的方式。TEV基因来自武汉淼灵生物科技有限公司的载体 pUC57simple-KF001AG2aFc，采用PCR的方式扩增获得。

在本发明提供的表达载体中，TEV基因可位于IGFBP-3基因的3’端，也 可位于IGFBP-3基因的5’端。

在本发明的实施例中，TEV基因位于IGFBP-3基因的5’端。

不同的载体会影响表达产物的得率，本发明以pUC57-simple为骨架制备 表达载体，表达产物得率较高。

作为优选，IGFBP-3基因和TEV基因的插入位点位于XbaI和BamHI之 间。

本发明提供的表达载体的制备方法，包括：

步骤1：以重叠PCR的方式连接IGFBP-3基因和TEV基因，获得 IGFBP3-TEV片段；

步骤2：分别以XbaI和BamHI酶切IGFBP3-TEV片段和pUC57-simple 载体后，将酶切后的IGFBP3-TEV片段和pUC57-simple载体连接获得表达载 体。

在本发明中，IGFBP-3基因的制备方法为根据Genbank登录号为3486的 序列人工合成后，将所述IGFBP-3基因克隆到大肠杆菌质粒载体 pUC57-simple中，获得pUC57simple-IGFBP3载体，以pUC57simple-IGFBP3 载体为模板，PCR扩增IGFBP3基因。

作为优选，PCR扩增IGFBP3基因的引物对的核酸序列如SEQIDNO:1～2 所示。