[发明专利]PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术及细胞治疗的技术工程领域，具体涉及一种PD-1基因重组病毒质粒，命名为病毒质粒KGEN-0626，于2016年1月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201601，本发明还涉及重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro的包装及在利用该重组病毒对肿瘤细胞进行免疫治疗中的应用。

背景技术

癌症已超过心脏疾病，成为全球第一大死亡原因。癌症治疗在过去几十年中取得了可喜的进展。肿瘤治疗除了外科手术外，还包括化疗、放疗及靶向药物治疗。尽管这些方法在一定程度上控制了癌症的发展，但其缺乏特异性，会在杀死肿瘤细胞的同时杀死正常细胞，此外这些药物治疗毒性大，严重损伤了正常免疫系统，影响病人的生存质量。

PD-1(Programmed Death 1)程序性死亡受体-1：是一种重要的免疫抑制分子。最初是从小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。PD-1抑制疗法是通过解除肿瘤逃避免疫系统能力的新型免疫治疗方法。癌细胞逃避免疫杀伤的一种机制，是通过它的表面产生一种称为程序性死亡配体-1(PD-L1).当这种PD-L1联接到一类免疫细胞T细胞的PD-1蛋白上即引起T细胞失活。T细胞就不能够发现肿瘤向免疫系统发出攻击肿瘤的信号。

该免疫治疗方法的设计思路是，针对肿瘤患者T细胞上的PD-1基因锁定或基因敲除，将使患者T细胞上的PD-1与肿瘤细胞表面的PD-L1不产生联接，从而激活患者自身的T细胞功能，达到杀死肿瘤细胞的目的。

目前美国已经有抗PD-1药物的临床实验，证明了这种机理治疗癌症成效显著。2014年施贵宝公司研制的Opdivo(PD-1抑制剂Nivolumab)先后在日本和美国上市，而默沙东公司研制的Keytruda(PD-1抑制剂Pemboolizamab)则是第一个在美国上市的用于晚期转移皮肤黑色素瘤(Melanoma)的抑制剂，该PD-1抑制剂在这些皮肤黑色素瘤晚期转移病人的临床实验中，被发现持续性地抑制肿瘤，大大提高病人的存活时间和存活率(60％的病人存活超过两年)。更令人振奋的病例发生在纽约斯隆.凯特琳癌症纪念研究中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center,MSK)的黑色素瘤病人的治疗反应。一位患有转移性黑色素瘤的49岁女患者，左胸下有一巨大有蒂的坏死性肿瘤。在进行一个剂量的试验性结合免疫治疗3周后，肿瘤消失了。此文发表在4月20号新英格兰杂志(NEJM)上。与此同时，MSK的Paul Chapman博士报道，其有效率达22％(74个病人中有16个治疗后未再发现肿瘤存在)。

另外，晚期非小细胞性肺癌(NSCLC)和肝癌(Hepatocellular Cancer)治疗中亦取得相当好的效果。在2015年第5届美国临床肿瘤年会(ASCO)中(5月29日至6月2日在美国芝加哥召开)，美国南加州大学Norris大学癌症中心Anthony B.EL-Khoueiry教授报导在一项I/II期研究成果表明Nivolamab治疗晚期肝癌是安全有效的。42名患者有8名患者(19％)肿瘤缩小30％，12个月总存活率为62％，最长达17个月，而目前市场上最新药物索拉菲尼(一种FDA批准的晚期肝癌治疗药物-多靶点酪氨酸激酶抑制剂)，客观肿瘤缓解率只有2％的患者有效，总生存率为10-11个月。施贵宝公司亦公布了Opdivo(Nivolumab)的试验数据，在对582位患者临床试验中，使用标准化疗法，四期肺癌患者生存期为9.4个月，而使用Nivolumab药物治疗，患者平均生存期提高到12.2个月，有的甚至到19.4个月。是常规标准化疗的近2倍。另外，默沙东的Keytruda(Pemboolizumab)是美国首个获批的抗PD-1药物，用于恶性黑色素瘤及非小细胞性肺癌。另外在临床试验中，对胃癌(Gastric Cancer)的有效率达53％的患者肿瘤缩小。食管癌(Esophageal Cancer)患者52％肿瘤缩小，头颈部肿瘤(Head and Neck Cancer)57％的肿瘤缩小。

综上所述，PD-1抗体药物治疗肿瘤疗效显著。然而目前国内尚无PD-1抗体，PD-1抗体治疗药物仍在研发之中，尚未进入临床试验。另外，PD-1抗体制备及纯化过程复杂，周期长，制造成本高，造成抗体药物昂贵，事实上普通百姓是难于承受这种高昂的治疗费用。

有鉴于此，我们发明了一个PD-1重组病毒的制备方法，并利用此重组病毒进行肿瘤的免疫细胞治疗。