[发明专利]一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法

权利要求书

1.一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，所述斑马鱼stat1a基因缺失实验设计区敲除后序列如SEQIDNo.1所示，该斑马鱼由如下步骤得到：

步骤一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计：

在NCBI上查询斑马鱼stat1a基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，设计一对stat1a基因的靶位点，靶点的选择遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’；其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，靶位点的3’端是NGG；

步骤二、构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成：

(1)首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)特异性gRNA体外合成

用BsaI限制性内切酶线性化此质粒；酶切反应总体积为20μL，体系如下：

离心混匀后于37℃水浴，酶切2h以上；

(3)以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA；

PCR引物上下游引物分别位于1号和3号内含子上：

F：5’-CAGAAATCGGGGGAAAAATATAC-3’

R：5’-TGCTGTTGTACCATGGCTATACTT-3’

正向引物F：T7启动子_20bp靶序列_20bpgRNA上游骨架

反向引物R：20bpgRNA下游骨架

PCR反应体系如下：

震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；反应条件为：预变性95℃8min，其中变性95℃30s，退火64℃30s，延伸72℃20s进行30个循环，再72℃8min；待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果；

(4)检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；

(5)测定纯化之后的DNA浓度，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA；转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：

体外转录反应体系：

将反应物都加入1.5mLRNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴1.5h；

水浴结束后，取1μL样品，用配制好的2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；

向转录体系中加入1μLDNA酶，放置于37℃水浴锅中反应20min，用以消化DNA模板，再取1μL转录终产物，即gRNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录效率；

(6)特异性gRNA的纯化

用RNeasyMinikit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃；吸取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度；

步骤三、斑马鱼胚胎的显微注射，显微注射体系如下：

在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中；

在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL；注射1.8nLCas9mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内；注射过的受精卵放置于5mmol/LNaCl，0.33mmol/LCaCl2，0.33mmol/LMgSO4，0.17mmol/LKCl的E3水中，28℃孵化；在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；

步骤四、T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性：

对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其stat1a基因是否存在突变，提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；

步骤五、注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤；

步骤六、目的序列的TA克隆：

T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序；若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；

步骤七、质粒的Sanger测序：

将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；

步骤八、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代：

通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出700bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到F1代；

如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体；

步骤九、获得斑马鱼突变体的F2代纯合子：

从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28℃培养，受精四天后取部分胚胎进行鉴定，将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增出700bp靶位点附近区域，通过BalⅠ限制性酶切分析并测序，初步检验是否可以得到stat1a突变体纯合子；如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定；

步骤十、依据步骤九方法进行该基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到这种新的斑马鱼品系。

2.根据权利要求1所述的一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，所述步骤四的具体操作为：

(1)提取斑马鱼基因组

斑马鱼胚胎50hpf受精50小时后，分别收集野生型做对照和注射后胚胎于1.5mLEp管中，每管5只胚胎，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：

向装有胚胎的Ep管中加入400μL细胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴锅中裂解2小时以上，期间每隔半小时，轻轻颠倒混匀，以保证胚胎被充分裂解完全；

裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积预先冷却的异丙醇于Ep管中，充分颠倒混匀，于4℃条件下，12000×g离心10min，倒掉上清液；

加入75％乙醇500μL，于4℃条件下，12000×g离心5min，弃上清液，室温风干20min；

加入60-100μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率

(2)PCR扩增目的序列

提取基因组DNA之后，根据CRISPR靶位点上下游约150-200bp的基因组区域，利用PrimerPremier5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段；

震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应，反应条件为：预变性94℃2min，其中变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃23s共30个循环，再72℃2min；待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确；

(3)若PCR产物正确，则用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，在紫外下切下目的条带，进行纯化回收；

(4)T7核酸内切酶I法

用T7E1分析检测是否存在突变，首先，取纯化回收之后的DNA15μL装于150μL的Ep管中，置于95℃热水中进行变性，然后自然冷却至室温，再取变性之后的DNA进行T7E1酶切，体系如下：

混匀体系后，于37℃水浴锅中酶切反应30min，再用2％的凝胶进行电泳，以检测目的DNA片段是否被切开，如若目的DNA片段下面有被切开的条带，则使用ImageJ软件，通过酶切后条带的亮度来估计非同源末端连接的频率；

另外，送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息。