[发明专利]一种提取鱼类肠道微生物基因组DNA的高温复合法

权利要求书

1.一种提取鱼类肠道微生物基因组DNA的高温复合法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取健康鱼肠道，无菌棉线结扎肠两端，无菌PBS缓冲液冲洗肠道壁上的血液、脂肪，挤压出肠道内含物，将肠道纵向剖开，刮取肠黏膜至肠道壁半透明状，将肠道壁剪成段；将肠内含物、黏膜及肠道壁碎块置于含PBS的离心管中，悬浮震荡3次，每次30s；随后4℃，800r/min，离心5min，取上清；4℃，5000r/min离心5min；弃上清，加入1.5ml PBS反复吹打，悬浮沉淀，得到菌液；

(2)将含有1.5ml菌液的2ml离心管插入装有碎冰的烧杯内，使超声波细胞破碎仪变幅杆置于菌液中，在150-250w条件下，超声2-3s，间隔5s，循环50-60次，以破裂微生物细胞，随后将菌液在4℃，10000-14000r/min，离心5min，收集沉淀；

(3)向沉淀中加入50μl的20mg/ml溶菌酶及750μl的1×TE缓冲液，移液枪反复轻柔吹打，重悬沉淀，在水浴恒温振荡器中，55-65℃条件下温育30min；冷却至室温，加入10μl的20μg/ml RNase A，在水浴锅中27-32℃温育30min；加入100μl浓度为100μg/ml的SDS、30μl浓度为20mg/ml的蛋白酶K，在65℃水浴恒温振荡器中往复式震荡2h；

(4)加入1ml苯酚-氯仿-异戊醇混合液，苯酚-氯仿-异戊醇混合液按体积比苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，颠倒混匀，在10000-14000r/min条件下离心2min，取800μl上清，移至新的离心管；随后加入800μl氯仿-异戊醇混合液，氯仿-异戊醇混合液按体积比氯仿：异戊醇＝24：1，颠倒混匀，在10000-14000r/min条件下离心5min，取600μl上清，移至新的离心管；加入60μl的3M NaAc和1.2ml在-20℃预冷的无水乙醇，置于-20℃冰箱中沉淀DNA 30min；10000-14000r/min，离心5min，收集沉淀；

(5)用体积百分比浓度75％乙醇洗涤沉淀2次，吸出剩余酒精，室温晾干，加入30-50μl在50℃预热的1×TE缓冲液，溶解DNA。

2.根据权利要求1所述的提取鱼类肠道微生物基因组DNA的高温复合法，其特征在于，所述步骤(1)为取健康鱼，用体积百分比浓度的75％乙醇擦拭体表，用钝头剪刀自肛门向脊柱方向剪开体壁，避开腹腔内组织，剪刀头上挑，防止损伤组织，剪至鳃盖后缘后，再沿鳃盖后缘剪至下颌，掀开体壁；用眼科剪分离出肠道，无菌棉线结扎肠两端；无菌PBS缓冲液冲洗肠道壁上的血液、脂肪；挤压出肠道内含物，用眼科剪将肠道纵向剖开，随后用解剖刀刮取肠黏膜至肠道壁半透明状，剩余肠道壁剪成段；将肠内含物、粘膜及肠碎块置于含PBS的离心管中，悬浮震荡3次，每次30s；随后4℃，800r/min，离心5min，取上清；4℃，5000r/min离心5min；弃上清，加入1.5ml PBS反复吹打，悬浮沉淀，得到菌液。

3.根据权利要求1所述的提取鱼类肠道微生物基因组DNA的高温复合法，其特征在于，所述步骤(2)中超声波破壁条件为：200W，超声2s,间隔5s，循环55次；所述步骤(3)中溶菌酶破壁孵育温度为60℃；RNaseA孵育温度为30℃。

4.根据权利要求1所述的提取鱼类肠道微生物基因组DNA的高温复合法，其特征在于，所述1×TE缓冲液为每100ml灭菌去离子水中含1ml的1M Tris-HCl和0.2ml的0.5M EDTA。