[发明专利]抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，确切讲本发明涉及一种抗羊痘病毒K3L蛋白的杂交瘤细胞株以及其分泌的抗羊痘病毒K3L全蛋白的单克隆抗体，以及这种杂交瘤细胞或抗体在制备检测或检测羊痘病毒试剂的应用。

背景技术

羊痘是羊疫病中一种高度接触性和具有毁灭性病毒病，被世界动物卫生组织（OIE）列为法定报告的动物疫病，以发热、结膜炎、鼻炎、皮肤和粘膜的痘疮、呼吸困难及死亡为特征。羊痘主要流行于非洲、中东、印度、尼泊尔土耳其的一些地区，国内主要流行于青海、甘肃、湖南和内蒙等地区。羊痘病毒（Sheeppoxvirus,SPV）属于痘病毒科、脊索动物痘病毒亚科、山羊痘病毒属，主要通过气溶胶、近距离接触或昆虫叮咬传播，绵羊是绵羊痘病毒主要的宿主，各年龄段均能感染，但是死亡病例主要发生于羔羊，死亡率高达100%，给养羊业造成重大的经济损失，被认为是经济上潜在的生物武器。因此，绵羊痘的诊断和防控一直是研究的热点。

中国发明专利2011103869424公开了一种羊痘病毒属病毒，包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒的芯片检测装置。该专利通过设计特异性探针，可对羊痘病毒属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒进行同时鉴定。本发明旨在建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片检测羊痘病毒属山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒的方法。

中国发明专利申请2013105940610和201310594930X分别公开了用于羊痘病毒胶体金检测试剂条的胶体金、金标抗体及其制备方法。所述胶体金中采用羊痘病毒P32单克隆抗体的最适宜标记量，所制备金标抗体复合物在可见光范围内进行扫描出现最大的吸收峰。这些方法都是针对病毒复制中、后期的核酸或者结构蛋白而建立起来的，因此，它们只能在病毒感染宿主12h甚至更长的时间之后才能检测出病毒是否存在。而本发明所制备的抗K3L蛋白的单克隆抗体在羊痘病毒早期感染检测中的应用，最早可在病毒感染细胞2小时检测到K3L的表达，24小时达到最大。因此，本发明涉及到的K3L抗体的制备可在羊痘病毒早期检测试剂或试剂盒中的应用。

发明内容

本发明提供一种抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体。

本发明的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25于2015年12月17日提交中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心的保藏，保藏编号为CCTCCNo：C2015222。

上述的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25可分泌单克隆抗体。

本发明所述的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25可在制备诊断试剂或检测羊痘病毒感染试剂中的应用。而本发明所述的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25所分泌的单克隆抗体也可在制备诊断试剂或检测羊痘病毒感染试剂中的应用。

此外，本发明的杂交瘤细胞株K3L25及所分泌的单克隆抗体也可在制备试验用的试剂中应用。

本发明的抗K3L蛋白的单克隆抗体制备方法是：由于羊痘病毒K3L基因中GC含量很高，经过前期摸索发现，通过常规方法直接克隆羊痘病毒的基因并不能表达获得K3L可溶性蛋白。因此，本发明根据SPVK3L基因序列，进行密码子偏好性分析和密码子优化改造后合成K3L基因全序列，与pUC57载体连接后，再将连接产物转化至DH5α感受态细胞，提取质粒并测序，将测序正确的重组质粒命名为pUC57-K3L。将K3L基因亚克隆至原核表达载体pET11d中，重组质粒命名为pET11d-K3L，再将重组质粒转化至BL21（DE3）plysS感受态细胞中，以IPTG为诱导剂对重组菌进行诱导表达，得到重组K3L可溶性蛋白，大量表达后通过收集上清，进行蛋白的收集和处理，最终将获得蛋白免疫Balb/c小鼠，并将小鼠的脾脏采集分离脾淋巴细胞与准备好的SP2/0细胞进行融合杂交，经细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养后，进行杂交瘤细胞的筛选和杂交瘤细胞的克隆化，冻存细胞并进行获得的单克隆抗体的特性鉴定后获得本发明的单克隆抗体。