[发明专利]一种猪生殖干细胞体外分化精子的建立方法在审
| 申请号： | 201610087392.9 | 申请日： | 2016-02-16 |
| 公开（公告）号： | CN105624101A | 公开（公告）日： | 2016-06-01 |
| 发明（设计）人： | 白银山;张守全;朱翠;冯美莹;卫恒习;李莉 | 申请（专利权）人： | 华南农业大学 |
| 主分类号： | C12N5/076 | 分类号： | C12N5/076 |
| 代理公司： | 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246 | 代理人： | 龚燮英 |
| 地址： | 510642 广东省广州市天*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 种猪 生殖 干细胞 体外 分化 精子 建立 方法 | ||
1.一种构建体外诱导精子分化的“Niche”饲养层的培养基，其特 征在于，所述培养基为含12-15％FBS，55μMβ-巯基乙醇，1％ITS， 1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH和1％ Penicilin-Stretomycin的DMEM培养基。
2.根据权利要求1所述的构建体外诱导精子分化的“Niche”饲养 层的培养基，其特征在于，所述培养基为含15％FBS，55μMβ-巯基 乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH 和1％Penicilin-Stretomycin的DMEM培养基。
3.一种支持猪生殖干细胞体外精子分化的培养基，其特征在于， 所述培养基为含10-12％FBS，55μMβ-巯基乙醇，1％ITS，1％L-谷 氨酰胺，1％核苷酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH和1％ Penicilin-Stretomycin的DMEM培养基。
4.根据权利要求3所述的支持猪生殖干细胞体外精子分化的培 养基，其特征在于，所述培养基为含10％FBS，55μMβ-巯基乙醇， 1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH和 1％Penicilin-Stretomycin的DMEM培养基。
5.一种猪生殖干细胞体外分化精子的建立方法，其特征在于， 包括以下步骤：
(1)、仔猪睾丸组织经分离培养，获取原代仔猪睾丸组织成纤维 细胞和生殖干细胞；
(2)、采用权利要求1或2所述的构建体外诱导精子分化的“Niche” 饲养层的培养基培养步骤(1)的睾丸组织成纤维细胞15天，构建得 到体外诱导精子分化的“Niche”饲养层；
(3)、将步骤(1)的生殖干细胞接种至步骤(2)的“Niche”饲养 层，培养27～30天，经细胞生物学分析，体外获得单倍体精子样细胞。
6.根据权利要求5所述的猪生殖干细胞体外分化精子的建立方 法，其特征在于，步骤(3)中所述生殖干细胞停止自我更新，采用 含10-12％FBS，55μMβ-巯基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％ 核苷酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH和1％Penicilin-Stretomycin的 DMEM培养基与“Niche”饲养层对生殖干细胞进行共培养。
7.根据权利要求5所述的猪生殖干细胞体外分化精子的建立方 法，其特征在于，步骤(3)中体外持续培养至30天。
8.根据权利要求5所述的猪生殖干细胞体外分化精子的建立方 法，其特征在于，步骤(3)中所述细胞生物学分析为细胞形态观察、 染色体倍型分析、减数分裂进程分析和精子基因检测。
9.根据权利要求5～8任一项所述的猪生殖干细胞体外分化精子 的建立方法，其特征在于，步骤(1)中仔猪睾丸组织经通过酶消化 法和贴壁法分离培养，获取原代仔猪睾丸组织成纤维细胞和生殖干细 胞。
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