[发明专利]一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白突变技术领域，特别是涉及一种具有强热稳定性的甜味蛋白 monellin突变体及其制备方法。

背景技术

甜味蛋白monellin是西非植物Dioscoreophyllumcumminsii中提取的一种天然 甜味剂，具有强烈的甜味，甜度在相同条件下约为相同质量蔗糖的3000倍，天然的monellin 蛋白是由两条不同的肽链通过共价键结合在一起，由A链和B链组合而成，研究发现天然的 monellin蛋白在高温下易失去活性，1989年Kim等人通过基因工程方法将两条肽链结合成 一条蛋白链，使其热稳定性得到大大提升，在宽范围PH下保持稳定，同时其甜度未发生太大 变化。由于本身不含糖分，可以作为糖尿病人和心血管病人的最好甜味替代食品，也可以有 效的预防儿童龋齿的发生，具有非常大的市场潜力。单链monellin蛋白在65℃下处理就会 失去活性，使其在生产和运输过程中受到了限制。

单链monellin蛋白采用基因工程手段也在其他生物中表达成功，如大肠杆菌表达 系统、植物表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、但是由于这些表达系统产量和有毒代谢物质 的问题使得monellin蛋白无法大规模发酵生产。采用甲醇诱导毕赤酵母发酵使得monellin 蛋白产量得到很大提升，但是由于有毒物质甲醇的加入，发酵产品安全问题成为隐患。

发明内容

本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种具有强热稳定性的甜味蛋白 monellin突变体及其制备方法。针对现有的技术不足，对单链monellin进行了定点突变研 究，得到一种热稳定性和甜度均提升的突变体E23A，并在毕赤酵母中成功表达，解决了甜味 蛋白在生产运输中易降解的技术难题，降低了monellin蛋白在生产运输中的成本，同时保 持其甜味效果，为甜味蛋白大规模工业化市场化打下基础。采用PGAPZαA质粒可以将目的蛋 白直接分泌到胞外，节省了后期纯化成本，由于本身为GADPH自诱导型启动子，发酵过程中 不需要添加任何诱导剂，减少了发酵过程中的染菌概率，同时没有任何有毒代谢物质，保证 了该蛋白作为食品添加剂的安全。

本发明的一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体及其制备方法技术方 案为，一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体，将野生型单链monellin基因第23 位氨基酸谷氨酸(Glu)定点突变为丙氨酸(Ala)。

与野生型单链monellin蛋白相比，甜味未下降，热稳定性提高20℃。

所述的一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体的制备方法，包括以下步 骤：

(1)构建野生型单链monellin蛋白表达载体；

(2)将步骤(1)中进行定点突变得到突变基因，挑取阳性转化子测序验证；

(3)将步骤(2)中测序正确的质粒转化入毕赤酵母中，筛选出成功转化的毕赤酵 母；

(4)在YPD培养基中诱导表达蛋白，时间为3天；

(5)将步骤(4)中表达的蛋白纯化。

步骤(1)为，构建含有野生型单链monellin蛋白基因的表达质粒PGAPZαA。

步骤(2)突变位点特异性引物：上游P1：[5’-CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTGAA- 3’]；下游P2：[5’-CATACTGACCTATTTTGTTAGCCTCGTCAACAG-3’],上游P3：[5’-CTGTTGACGAGGCTAACAAAATAGGTCAGTATG-3’]；下游P4：[5’-TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3’]。

步骤(2)中，设计好引物后，用Xhol和NotI两种限制性内切酶处理PGAPZαA-SCM，胶 回收目的基因和开环质粒，根据以下体系进行PCR反应：

上述PCR反应按照如下程序进行：