[发明专利]一种长链非编码RNAuc.77及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，涉及一种新型人鼠同源性非编码RNA uc.77以及在制备诊断肺纤维化疾病试剂药物中的应用。

背景技术

肺纤维化（Pulmonary fibrosis，PF）是一种渐进性疾病，由急、慢性肺间质疾病演化而来，是多种间质性肺病终末期的共同状态及病理表现。随着我国各类原因导致的肺纤维化患病率不断上升，肺纤维化已成为我国呼吸系统主要疾病之一，其晚期及急性加重状态在急危重症中的比例不断升高，且与不良预后密切相关。

目前临床诊断肺纤维化疾病主要包括以下几种手段：一、影像学检查：胸部高分辨CT（HRCT）检查，能细致的显示肺部病变的位置、程度及性质，对某些类型的肺纤维化如特发性肺纤维化等的诊断具有指导意义。二、肺功能检查：肺功能检查亦是诊断肺纤维化不可缺少的检查项目，有助于了解肺通气与弥散功能等情况，尤其是动态肺功能演变更能反映疾病的发展和预后。三、外科手术活检：可根据肺活检病理做出明确的疾病诊断。但目前的诊断手段和策略都很难做到早期诊断，往往在疾病进展到一定程度以后，患者才因为症状逐渐明显而得到确诊和治疗。呼吸困难是肺纤维化最常见症状。轻度肺纤维化时，呼吸困难常在剧烈活动时出现，因此常常被忽视或误诊为其他疾病。当肺纤维化进展时，在静息时也发生呼吸困难，严重的肺纤维化患者可出现进行性呼吸困难。肺组织纤维化的严重后果，导致正常肺组织结构改变，功能丧失。当大量没有气体交换功能的纤维化组织代替肺泡，导致氧不能进入血液。患者呼吸不畅，缺氧、酸中毒、丧失劳动力，严重者最后可致死亡。由于肺纤维化后期所带来的严重后果，因此，及早的对其进行诊断具有重要意义，早期诊断，从而做到早期预防和早期治疗以期待获得更好的治疗效果。但在早期阶段，由于现有技术的限制，常被漏诊甚至误诊为其他疾病，容易延误最佳的治疗时期，成为目前临床上呼吸系统疾病的难点之一。

近年来表观遗传学成为多种疾病研究的热点与重点，且逐渐成为肺纤维化研究的一个重要方向。表观遗传学是指在基因组DNA序列不变的情况下，通过改变DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体结构参与基因表达调控的一种可逆、可遗传的遗传信息。目前已知，人体基因组中的98%不编码蛋白质的基因组DNA大多可转录产生非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。而这些ncRNA即介导和参与了表观遗传学的机制。根据成熟转录本大小的不同，ncRNA可分为小分子ncRNA( 如siRNA、miRNA、piRNA等)，中等长度ncRNA(70-200nt) 和长ncRNA(long ncRNA，lncRNA，≥ 200nt)。目前，ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA，而对lncRNA的研究还处于起步阶段。长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200nt、自身不编码蛋白、且物种间相对保守的RNA，已知其可参与X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰等多种重要生物过程。

发明内容

本发明通过构建小鼠肺纤维化模型，应用lncRNAmicroassay技术（Mouse lncRNA Microarray V2.0, Arraystar.Inc，探针覆盖31,423 条lncRNA、25,376 条编码基因），开展小鼠正常肺组织、纤维化肺组织之间差异lncRNA的筛选，通过序列分析，共得到纤维化肺组织相对正常肺组织高表达5倍以上的lncRNA有513条、低表达5倍以上的lncRNA有204条。对芯片检测到的具有人鼠同源性的，差异表达基因、同时又被预测为差异lncRNA可能调控靶标的编码基因，进行Go和Pathway生物信息学分析，发现一条lncRNA-uc.77，其核酸序列如SEQ ID No.1所示。经定量PCR检测结果表明此lncRNA在肺纤维化组织中高表达，而在正常组织中低表达。构建lncRNA-uc.77的质粒过表达载体，并转染人肺泡上皮细胞A549，结果表明其明显促进其目的基因ZEB2的表达，因此相应的影响了肺泡上皮细胞转化为肌纤维母细胞的上皮间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）过程，表现为：细胞形态发生改变，诱导人肺泡上皮细胞中成纤维母细胞标记物：Vimentin、α-SMA、N-cadherin表达增加；上皮细胞标记物：E-cadherin、EpCAM、KRT-5表达下降；细胞外基质标记物：MMP-2、MMP-9表达增加。使用lncRNA-uc.77的质粒过表达载体转染人支气管上皮细胞（HBEc）所获得的结果与A549细胞系的结果一致。