[发明专利]建立克服基因功能冗余的全基因组功能缺失筛选方法

说明书

目前，全基因组范围内的功能缺失高通量筛选已普遍应用于各个生物过程中基因功能的研究。然而，普遍存在的基因功能冗余现象对于全面深入研究基因功能造成了很大的干扰。为此，本发明人基于基因家族建立了siRNA组合文库，该基因家族siRNA组合文库对功能相似基因的表达同时进行干扰。以检测Wnt3a诱导的β‑catenin蛋白质的稳定性为出发点，证明了相比于常规的单基因siRNA文库，基于基因家族siRNA组合文库的筛选能克服同一家族基因间的代偿效应所引起的假阴性现象。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及建立克服基因功能冗余的全基因组功能缺失筛选方法及其应用。

背景技术

探索基因及其表达蛋白质在各种生理和病理过程中的作用是生命科学领域中永恒的研究主题，而高通量的功能缺失筛选成为了最强有力的研究工具之一。随着科学技术的发展，功能缺失筛选从早期的基于诱导DNA突变的筛选进入到最近10几年来兴起的大规模全基因组RNA干扰筛选时代。RNA干扰技术原理是利用小RNA片段靶向目的基因序列而沉默基因表达的^[1]。目前RNA干扰(RNA interference,RNAi)文库被广泛应用于功能缺失型基因筛选^[2-4]。这种文库主要分为siRNA和shRNA两类,二者的原理都是通过RNA干扰降低目的基因的表达来引起表型改变。siRNA为人工合成的短RNA片段,能在微孔培养板中进行彼此独立的表型筛选,配合高通量液体工作站等自动化机器，能稳定快速简便地获取目标信号或者图像等表型信息,因而被广泛应用。shRNA则是通过构建到慢病毒等表达载体上，通过病毒侵染方式进行混合型文库筛选,再通过微阵列芯片或者深度测序技术对筛选后富集的shRNA进行分析。混合型shRNA文库筛选具有简便、经济等特点,但是观察表型仅局限于细胞生长。最近，规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspacedpalindromic repeats，CRISPR-Cas9)这一强大的基因编辑工具，如风暴一般席卷了整个基因组工程领域，它是利用特异靶向目的基因的gRNA指导Cas9蛋白切割特定的目的DNA序列，从而起到基因编辑的作用^[5,6]。并且，和shRNA相似的混合型gRNA文库筛选也已经应用于生物研究^[7-10]。相信随着科学技术的进步，在不久的将来，shRNA和gRNA文库也能结合高通量自动化仪器进行多样化的表型筛选。

综上所述的功能缺失筛选都面临一个共同问题，即基因功能冗余所导致的假阴性表型。而事实上，基因功能冗余在基因组中又是一个非常普遍的现象。因为在进化过程中，功能冗余是生物体为了克服突变等功能缺失而衍生出的一种保护机制^[11-13]。但是在功能缺失筛选中，功能冗余却会带来很大的干扰。因为基因间存在的代偿效应，往往使得沉默单个基因观察不到表型的变化。因此本领域中致力于开发能够克服基因功能冗余所导致的假阴性问题，高效、准确的鉴定基因功能的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供建立克服基因功能冗余的全基因组功能缺失筛选方法。

本发明的第一方面，提供了一种构建靶向基因家族的组合siRNA文库的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供一蛋白组群；

(2)根据所述蛋白组群中的各蛋白序列信息，进行基于结构域的多序列比对，把具有相同结构域的蛋白归为一类，形成蛋白超家族；