[发明专利]高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法

说明书

本发明公开了一种高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法。狗牙根的遗传转化非常困难，严重制约了其基因功能研究和分子育种工作的开展。本发明公开的新方法利用农杆菌介导的水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体特异性地下调狗牙根内源基因的表达，为研究狗牙根的基因功能提供了高效快捷的技术手段。所述方法包括以下步骤：1）狗牙根目的基因片段的克隆；2）病毒诱导基因沉默载体的构建；3）农杆菌浸染狗牙根植株；4）基因表达丰度的分子检测。使用本方法可以成功使狗牙根内源基因的表达降低50%以上。

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的病毒诱导基因沉默技术用于高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法，属于基因工程和生物技术领域。

背景技术

狗牙根（Cynodon dactylon（L.）Pers.）是禾本科虎尾草亚科狗牙根属植物，是一种重要的暖季型草坪草、牧草及水土保持植物，具有耐旱、耐盐、耐践踏、病虫害少、生长快、草层厚等诸多优点，广泛用于暖温带、亚热带及热带的运动场草坪、公园和道路绿化带、河道和山坡等护坡草坪和放牧草地建设，在草坪和牧草生产中具有十分重要的地位。

对狗牙根抗逆、发育相关重要基因的功能进行深入研究能够为基因工程育种和分子辅助育种提供重要的候选基因和理论依据。然而目前所建立的农杆菌浸染和基因枪轰击介导的狗牙根遗传转化方法均步骤繁琐且效率低下，严重阻碍了在狗牙根植物体内进行相关基因功能的验证。病毒诱导的基因沉默技术利用病毒感染植物后植物对病毒RNA序列进行特异性识别和降解的机制，将目标基因序列融入病毒序列中，使感染重组病毒的植物体内目标基因mRNA也被识别和降解，是一种高效抑制基因表达的技术方法。目前已有多个病毒诱导基因沉默载体得到构建，成功用于烟草、番茄、棉花、拟南芥、水稻、二穗短柄草等植物的基因沉默实验。然而截至目前，仍未有狗牙根病毒诱导基因沉默技术的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法，通过如下技术方案实现。

（1）狗牙根目的基因片段的克隆。

在已知狗牙根目的基因序列情况下，设计PCR扩增目的基因片段的上下游引物，设计原则保证PCR扩增产物长度大于100bp，同时在上下游引物5’端分别添加限制性内切酶MluI和PacI的识别碱基序列ACGCGT和TTAATTAA。提取狗牙根RNA，逆转录成cDNA，使用高保真酶PCR扩增获得目的基因片段。电泳、切胶回收预期大小的PCR产物，连接平末端PCR产物克隆载体，转化大肠杆菌DH5α，涂布抗性平板，挑取克隆，用载体自带引物PCR鉴定获得阳性克隆后，测序确认PCR产物的正确性。

在狗牙根目的基因序列未知情况下，可以根据目的基因在其它物种的同源基因序列设计简并引物先从狗牙根cDNA中PCR扩增获得部分基因序列，测序确认序列正确性后遵照上述方法获得目的基因片段。

（2）病毒诱导基因沉默载体的构建。

提取上述测序验证的含有狗牙根目的基因片段的PCR产物克隆载体质粒和水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体pRTBV-MVIGS质粒，使用MluI和PacI两个限制性内切酶于37℃酶切8小时；电泳、切胶回收目的基因和pRTBV-MVIGS载体酶切片段，使用T4 DNA连接酶将摩尔比为3：1的目的基因和pRTBV-MVIGS载体酶切回收片段进行连接，连接条件为16℃8小时；将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布卡那霉素抗性平板，挑取克隆，使用载体酶切位点两侧序列设计的引物RTBV-F（序列：GGATCCGGGCCCTTAATTA）和RTBV-R（序列：AGGCTGGAGGCATAAACGC）进行菌落PCR，对克隆进行鉴定。

（3）农杆菌浸染狗牙根植株。