[发明专利]一种玉米穗腐病病原物的双重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分子技术领域，涉及一种快速灵敏检测技术，具体涉及一种玉米穗腐病 病原物的双重PCR检测方法。

背景技术

玉米是我国重要的粮食作物之一。随着食品工业和饲料产业的发展，玉米作为主要食品 和饲料作物的地位也日益上升(徐彦，2010)。玉米穗腐病又名玉米穗粒腐病，是由多种病原 菌引起的世界性玉米病害(邹庆道，2000)，不仅直接造成玉米产量损失，其病菌产生的毒素 还影响玉米的品质，对玉米及其饲料的食品安全性构成威胁(胡韬纲，2015)。由于农业生产 方式的变化，特别是秸秆还田普遍实施，玉米穗腐病有不断加重的趋势。镰刀菌是引起玉米 穗腐病的主要病原菌，不同气候带玉米产区中，玉米穗腐病致病镰刀菌的种群结构可能发生 改变(陈捷，2000)。不同的镰刀菌侵染规律有一定差异，其所产生的真菌毒素种类也有明显 不同，因此快速准确地鉴定该病的病原菌是进行玉米穗腐病监测及防控的基础。

据报道，引起玉米穗腐病的病原菌主要有拟轮枝镰刀菌(Fusariumverticilioide，异名为串珠镰刀菌F.moniliforme)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、层出镰刀菌(F.proliferatum)、青霉菌(Penicilliumspp.)、蠕孢菌(Bipolarisspp.)、曲霉菌(Aspergillusspp.)和木霉菌(Trichodermaspp.)等(李洪连等，1999；Schaafsma等，2008；任旭，2011)。近20年来，国内外对玉米穗腐病的病原开展了相关研究，Fandohan等(2003)认为拟轮枝镰刀菌和层出镰刀菌为主要病原，它们是伏马毒素(fumonisin)的主要生产者。Schaafsma等(2008)报道加拿大玉米穗腐病主要致病镰刀菌为胶孢镰刀菌、拟轮枝镰刀菌、禾谷镰刀菌，分离比例依次为32.9％、24.5％和19％。2006年及2007年，德国主要产区玉米感染镰刀菌的平均比例分别为32.4％和24.7％，而轮枝镰刀菌、禾谷镰刀菌及层出镰刀为主要致病种(eta1.，2008)。在巴西，玉米镰刀菌的分离比例大约为60％，其中轮枝镰刀占优势，其他菌还包括青霉(Penicilliumspp.)和枝顶孢属(Acremoniumspp.)(Pamphileeta1.，2002)；在尼泊尔，玉米穗腐病主要病原为拟轮枝镰刀菌和禾谷镰刀菌，99％的病穗均分出镰刀菌(Desjardinseta1.，2000)。国内，潘惠康等(1987)报道了玉米穗腐病主要病原为拟轮枝镰刀菌，其他研究也得到类似结果(张清润等，1991；史晓榕等，1992；黄长岭等，1990)。马秉元等(1995)从陕西采集的570份玉米病穗中共分离出17种真菌，拟轮枝镰刀和禾谷镰刀菌为主要病原，李顺德等(1998)报道云南玉溪地区玉米穗腐病主要由禾谷镰刀菌引起，比例高达90％，在四川，玉米穗腐病主要病原为轮枝镰刀菌和木霉菌(陈晓娟等，2002)。罗晓杨等(2009)报道9600粒种子中镰刀菌的分离频率最高，为32.9％，其次为曲霉(3.7％)和青霉(2.4％)。普遍认为拟轮枝镰刀菌为优势病原菌，禾谷镰刀菌次之(邹庆道等，2003；徐书法等，2006)。河北、陕西、吉林玉米产区引起穗腐病的镰刀菌以拟轮枝镰刀菌为优势种(孔令晓和罗畔池，1995；任金平，1995；马秉元等，1998)，云南玉溪地区则以禾谷镰刀菌为优势种(李顺德和黄业修，1998)。本课题组调查发现，玉米穗腐病的病原菌与品种有一定关系，近年黄淮玉米产区普遍推广的郑单958其穗腐病的病原菌在河南省以禾谷镰刀菌为优势种，可能与其对不同穗腐病菌的抗性有关。

总之，拟轮枝镰刀菌及禾谷镰刀菌是两种主要的玉米穗腐病的病原菌，二者侵染规律有 所不同，防治上也需采用不同的方法。寻找一种快速、灵敏、准确的检测方法对玉米穗腐病 的防控具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是建立引起玉米穗腐病的两种主要病原菌的双重PCR检测体系，为玉米穗 腐病的防控奠定了扎实的基础。

一种玉米穗腐病病原物的双重PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)真菌菌丝的收集；

(2)真菌DNA的提取；