[发明专利]前列腺癌特异性PAP-GM-CSF-IL-6基因重组融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因重组蛋白的制备，特别涉及前列腺癌特异性PAP-GM-CSF-IL- 6基因重组融合蛋白的制备方法。

背景技术

前列腺癌在西方国家男性高发的恶性肿瘤中，其死亡率高居癌症死亡率的第二 位，仅次于肺癌。自20世纪90年代起，前列腺癌的实验研究在我国受到了重视并迅速开 展，然而晚期前列腺癌和雄激素非依赖阶段的列腺癌，对其相关的发病机制知之甚少，尚无 有效的治疗方法，当前的研究仍然处于摸索阶段，还需要通过大量的体内外实验进一步深 入的探索。2008年12月，美国FDA正式批准DC诱导的肿瘤免疫治疗应用于临床，目前应用的 肿瘤抗原有多种，包括肿瘤细胞裂解物、肿瘤相关全抗原、蛋白多肽、蛋白单肽等，现有的DC 疫苗制备方法中大多数采用肿瘤组织块或癌相关蛋白作为靶向物质，负载效率低，靶向性 较低，特异性较差。

前列腺特异性酸性磷酸酶(prostaticacidphosphatase，PAP)是酸性磷酸酶同 工酶，由前列腺上皮细胞溶酶体产生，是一种由两个相同亚单位组成的糖蛋白，其分子量为 100kD。在前列腺癌时，血清中PAP水平明显升高，且其升高程度与前列腺癌的病情基本呈平 行关系。当病情好转，PAP水平降低，常提示癌症有复发、转移及预后不良。研究还发现，应用 抗PAP抗体，能够有效检测出循环血中游离的癌细胞（Circulatingtumorcells,CTC），并 且对腹腔广泛转移和种植所致腹水，具有良好的疗效。因而，PAP可作为前列腺肿瘤极好的 靶标和抗原，应用于肿瘤检测及肿瘤特异性细胞免疫治疗。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor,GM-CSF）是一种多小性的细胞因子，可促进DC等APCs的分化、成熟和活化，也可增 加DC表面的主要组织相容复合物Ⅱ，促进肿瘤抗原的有效递呈。GM-CSF对于红细胞和巨核 细胞的增值和分化也起到促进作用，在DC的培养过程中，GM-CSF是不可或缺的细胞因子，促 进DC的活化能力，从而增强DC疫苗的抗原提成能力，从而促进抗原特异性细胞毒T淋巴细胞 （CytotoxicityTlymphocytes,CTL）的杀伤功能。

白细胞介素-6(Interluekin-6，IL-6)，是一种具有多功能的生物活性多肤物质， 主要来源于单核巨噬细胞，部分来自于T、B淋巴细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞，某些肿瘤 细胞也能产生IL-6。IL-6在促进机体免疫应答、增强骨髓造血、提高自身免疫和机体防御能 力等方面均具有重要作用。它的作用主要体现在ThZ型免疫反应中，对多种细胞的增殖都具 有促进作用，如刺激杂交瘤、浆细胞瘤和骨髓瘤生长；刺激T细胞生长；促进EBV转化的B细胞 生长；促进造血干细胞生长及刺激肾小球系膜生长等。它对髓样白血病细胞系的生长具有 抑制作用；还能抑制黑素瘤、乳腺癌细胞等的生长增殖。并可作为某些中性细胞的催化剂， 与其他细胞因子协同作用从而促进骨髓干细胞的成熟。因此IL-6在人类疾病的治疗上，常 用于治疗由放疗、化疗所引起的血小板减少症、癌症等疾病或者作为疫苗的强效佐剂应用 于临床试验。

发明内容

本发明的目的在于应用基因重组技术，将前列腺癌特异性PAP、GM-CSF及IL-6重组 偶联，制备成高纯度的PAP-GM-CSF-IL-6融合蛋白，为细胞免疫治疗提供一种能促进DC疫苗 抗原递呈功能的前列腺癌特异性重组蛋白抗原，从而显著提高细胞免疫治疗的临床疗效。

本发明提供一种前列腺癌特异性PAP-GM-CSF-IL-6基因重组融合蛋白，三种蛋白 的氨基酸序列均为已知序列。

本发明所采用的技术方案是：提供前列腺癌特异性PAP-GM-CSF-IL-6基因重组融 合蛋白的制备方法，所述的重组蛋白的连接顺序为PAP-linker1-GM-CSF-linker2-IL-6，所 述方法步骤如下：

（1）引物的设计与合成；

（2）基因扩增和测序；

（3）重组载体pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-IL-6的构建；

（4）重组载体pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-IL-6的筛选、鉴定；

（5）重组质粒pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-IL-6转染HEK293细胞株；

（6）重组PAP-GM-CSF-IL-6融合蛋白在HEK293细胞株内表达；