[发明专利]基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法有效

专利信息
申请号: 201610095634.9 申请日: 2016-02-22
公开(公告)号: CN105664258A 公开(公告)日: 2016-06-15
发明(设计)人: 韩立军 申请(专利权)人: 江苏期佰医疗技术有限公司
主分类号: A61L27/38 分类号: A61L27/38;A61L27/36;C12N5/071;C12N5/077
代理公司: 南京纵横知识产权代理有限公司 32224 代理人: 董建林
地址: 215000 江*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 基于 小肠 黏膜 下层 细胞 基质 制备 平滑肌 载体 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及一种基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法,属于医学皮肤组织工程技术领域。

背景技术

生物衍生材料具有与细胞外基质相似的结构和良好的生物相容性,是一种非常有优势的组织工程支架材料。在众多的生物衍生材料中,小肠粘膜下层(SIS)具有低免疫原性,抗菌性和促进组织生长等优势,所以被认为是一种非常理想的组织工程支架材料。

SIS中含有丰富的蛋白多糖、胶原蛋白和纤维粘连蛋白,能促进细胞与组织间的黏附、增殖和分化。蛋白多糖常在细胞黏附的早期阶段,如细胞的附着和伸展阶段起作用;胶原蛋白通过I型胶原的α1链,纤维粘连蛋白通过RGD序列与细胞膜受体特异结合,激活信号传导通路促进细胞黏附。

SIS包含的多种生长因子,如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)等在组织的修复和重构中有着重要的促进作用。SIS具有独特的解剖结构:胶原纤维间的类肝素硫酸蛋白聚糖主要集中在血管;呈弥散分布;VEGF则主要分布在血管周围。这种结构在组织再生中发挥重要作用。

目前国内外用于阴道组织工程研究的主要支架材料聚乙醇酸存在降解过快等缺陷。天然脱细胞支架材料尤其是小肠黏膜下层逐渐成为组织工程研究的重点。

阴道是女性重要生殖器官,由于先天性疾病或后天损伤、肿瘤等原因造成的部分或全部缺失,需要进行修复和再造。应用各种自体或异体组织进行阴道修复时,不但会造成新的损伤,而且术后可能出现再造阴道挛缩、分泌物过多及异味等现象,另外再造的阴道在组织学、形态学和功能方面都与正常阴道组织有很大差异。倘若能利用患者自身的少量细胞,通过组织工程技术“再造”出接近自然的阴道组织,再覆盖阴道穴腔,则无疑是一种新型的、理想的阴道成形术。

2003年,DeFilippo等将阴道上皮细胞和平滑肌细胞种植于包被有50:50异量分子聚合物(左旋和右旋的内交脂和乙醇酸交脂聚合物)的聚乙醇酸支架上成功地构建了组织工程阴道组织,种植于其上的阴道上皮细胞和阴道平滑肌细胞生长增殖良好。但聚乙醇酸材料在免疫原性、抗微生物原性、能促进组织再生等特性与天然支架材料相比还有一定的差距。小肠黏膜下层(smallintestinalsubmucosa,SIS)基质作为天然细胞外基质类生物衍生材料,是自猪小肠解剖出其黏膜下层经处理后获得富含胶原的生物材料,具有无免疫原性、抗微生物原性、能促进细胞再生、提供细胞生存和铺展的三维空间,利于细胞新陈代谢等特性,在实验和临床工作中已被较多用于血管、膀胱、神经及腹壁等组织缺损的修复,显示出良好的组织相容性。Rotariu等用猪SIS修复兔长达2.5cm尿道缺损,观察到SIS能促进尿道上皮的再生,组织学检查见基质中新生的尿道组织层几乎与正常无差别。Gabouev等将膀胱上皮细胞和膀胱平滑肌细胞种植在SIS上,免疫组化显示形成了膀胱上皮和膀胱平滑肌细胞双层结构,成功地制成了组织工程化膀胱。本发明制备无细胞成分的SIS细胞基质,将培养扩增阴道平滑肌细胞种植于SIS上,体外复合培养观察细胞在该材料上黏附、增殖、侵入情况,以探讨猪SIS用作组织工程学阴道平滑肌细胞载体的可行性,为研制无细胞基质组织工程学阴道奠定基础。

发明内容

目的:为了克服现有技术中存在的不足,本发明提供一种基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法。

技术方案:为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:

一种基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法,包括以下步骤:

1)SIS制备:

物理方法处理:小肠取自体质量>200kg的家猪;在运输过程中将小肠冰冻冷藏,在4h内完成清洁过程;用裹有纱布的刀柄去除小肠的浆膜层和肌层,其间持续用40℃温水冲洗;

化学方法处理:沿纵轴切开经物理方法处理的小肠,切成每段15cm长,按Abraham方法制备;化学方法处理过程的每一步均在室温下进行,材料与溶液积的比例都保持在1:100;

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