[发明专利]基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA的提取方法，属于生物技术领域。

背景技术

血浆是血液除去血细胞和血小板外的液体组分，约占全血体积的50-60％。通过抗凝采血管采集血液，离心后收集到的上层淡黄色液体即为血浆。研究表明，在血浆中除了水分、血浆蛋白、氨基酸、糖类和无机盐等化学成分外，还存在游离于细胞之外的脱氧核糖核酸分子，称为血浆细胞游离DNA。近年来，血浆细胞游离DNA在医学诊断中的应用不断拓展，其广泛应用于无创产前筛查、肿瘤液体活检和肿瘤个体化用药指导等领域。

提取高质量的血浆细胞游离DNA是对其进行深入研究和进行医学诊断的基本前提。血浆细胞游离DNA由于其片段短(几十到几百bp不等)、丰度低(正常人体血浆中每毫升含量为几纳克至几十纳克)的特点，其提取难度大于体细胞的基因组DNA。在实际应用中，为了避免DNA片段信息的丢失，对于血浆细胞游离DNA的提取有着高效提取、避免损失的要求。目前用于提取血浆细胞游离DNA的方法主要有离心柱法和磁珠法两大类，但是在实际应用中均存在提取效率偏低、部分DNA片段易丢失、批次操作效果不均一的问题，这对于血浆细胞游离DNA的研究应用造成了不利影响。

发明内容

本发明公开了一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA的提取方法，该方法能高效、快速地获得高质量的细胞游离DNA，可以满足PCR扩增、定量和定性分析、测序等分子生物学实验的要求。

为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，具体包括如下步骤：

(1)预处理，取血浆样品置于离心管中，加入预处理液P，在50-60℃水浴中保存0.5-1h，预处理液P：0.5-3％(w/v)蛋白酶K，1-3mM氯化钙。由于血浆细胞游离DNA能与蛋白形成复合物，因此通过预处理降解血浆蛋白，有助于提高血浆细胞游离DNA的捕获效率和实验结果一致性。

(2)配置结合液B，在两步温控条件下采用羟基磁珠特异性吸附样品中的DNA，具体地，向经过预处理的样品中加入结合液B；漩涡振荡15-30s；在50-60℃水浴中反应3-5min；从水浴中取出离心管，漩涡振荡15-30s；使用旋转混合仪，在室温条件下反应5-10min；计时结束后，在3000-4000g条件下离心30-60s，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠。上述用到的结合液B：92-98％(v/v)异丙醇，1-3％(v/v)非极性溶剂，1-5％(v/v)磁珠悬浮液，其中，磁珠悬浮液为20％(w/v)纳米磁珠，非极性溶剂为石油醚、正己烷、四氯化碳、苯中的一种或多种混合，添加非极性溶剂的目的是增加溶液环境的非极性，促进核酸分子被纳米磁珠吸附。

(3)洗涤，配置洗涤液W1和W2对吸附有DNA的磁珠进行清洗，具体地，首先盐洗涤去除杂质，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液W1，漩涡振荡2-3min；静置1-2min后在3000-4000g条件下离心30-60s，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠；然后进行醇洗涤去除盐分，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液W2，漩涡振荡2-3min；静置1-2min后在3000-4000g条件下离心30-60s，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠，敞开管口室温放置10min以便乙醇挥发，洗涤液W1：5-20mM三羟甲基氨基甲烷，1-5mM乙二胺四乙酸，60-75％(v/v)乙醇；洗涤液W2：70-80％(v/v)乙醇。