[发明专利]一种具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架及其制备方法

权利要求书

1.一种具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将GFP基因转染进入hiPSc中，得到携带GFP基因的hiPSc，命名为GFP-hiPSc，然后将GFP-hiPSc诱导形成的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞经诱导分化培养基重悬后接入包被基质胶Matrigel的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上，于诱导分化培养基中进行诱导分化，形成具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基；

所述的诱导分化培养基为：每ml含有bFGF 10ng、BDNF 20ng、CNTF 20ng、N2supplement1ng、非必须氨基酸1ng、肝素2μg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合而成。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的诱导分化是在37℃、5％CO₂，饱和湿度下进行诱导分化。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的将神经纤维层消化为单细胞是将神经纤维层放入D-Hanks液中，分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分，保留金黄色的组织部分的神经纤维层，将分离的神经纤维层组织用PBS冲洗，吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞团成单细胞后加入诱导分化培养基终止消化，混悬液离心去上清后，得到种子细胞。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的将GFP基因转染进入hiPSc中是用携带GFP基因的逆转率病毒载体转染hiPSc。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的用携带GFP基因的逆转率病毒载 体转染hiPSc是将逆转录GFP包装的PT67细胞用含有300μg/ml G418的DMEM培养基筛选5天，去除含G418的DMEM培养基，再加10％胎牛血清培养液，待细胞达到95-100％融合后收集上清，将上清联合3000Reagent加入hiPSc中，感染24小时后，获得GFP-hiPSc。

6.一种按照权利要求1、2、3、4或5所述的制备方法制备得到的具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架。