[发明专利]猪伪狂犬病毒变异株TK、gE和gI基因缺失毒株及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用于制备疫苗的猪伪狂犬病毒变异毒株，特别涉及一种猪伪狂犬病毒变异毒株TK、gE和gI基因缺失的毒株。

背景技术：

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种猪的重要传染病，主要临床症状包括：新生仔猪中枢神经系统紊乱、断奶仔猪和育肥猪表现出呼吸道症状、妊娠母猪繁殖障碍，已经给世界生猪养殖业造成巨大经济损失 ^[1-3]。目前，该病防控主要依靠疫苗免疫，美国与部分欧洲国家已宣布通过基因缺失疫苗免疫和净化技术，根除了该病在家猪中的流行^[4]。近30年来，我国广泛使用PRV基因缺失弱毒疫苗，该病得到有效控制并逐步净化^[5-6]。但是，2011年以来，我国许多免疫PRV活疫苗的猪场再次暴发该病，主要表现为仔猪神经症状及死亡，生长猪呼吸道症状，妊娠母猪流产、死胎、弱仔等，对该病防控提出新挑战。

gE基因在PRV入侵宿主神经系统(包括三叉神经节和嗅神经)的扩散发挥重要作用，是PRV主要毒力基因，同时也是病毒复制的非必须基因。gE与gI是以非共价键形式结合成gE/gI复合物。最新研究表明gE/gI复合物与病毒顺轴突传播相关。gE/gI基因的缺失并不影响病毒的增殖滴度。敲除PRV TK和gE会导致一些PRV毒株毒力的显著下降，并可用于研制PRV弱毒活疫苗。

本发明选择一种PRV变异强毒株ZJ01，成功构建ZJ01株的感染性细菌人工染色体克隆，并获得TK、gE和gI基因缺失毒株ZJ01ΔTK/gE/gI(简称ZJ01R)和ZJ01ΔgE/gI。体外连续传代培养试验证明，该两个重组病毒的滴度和遗传特性稳定。仔猪接种该病毒后体温平稳，无组织损伤，接种7日后即产生较高的gB抗体，21日时能够产生较高的中和抗体。以大剂量变异强毒株进行攻毒，对照组全部死亡，重组病毒ZJ01R免疫组猪不发生死亡，无体温升高和组织病变，肺脏及脑组织中未检测到病毒，证明该重组病毒对猪体具有良好的免疫保护效 果，且对猪体不产生病理损伤，是理想的基因缺失疫苗候选对象，为研制PRV新型疫苗奠定了重要基础。

发明内容：

本发明提供一种猪伪狂犬病毒变异株TK/gE/gI基因缺失毒株，其保藏编号为：CGMCC No.10397，分类命名：猪伪狂犬病毒，PRV-ZJ01R。本发明所述的毒株，结构为ZJ01TK^-/gE^-/gI^-。

本发明所述的毒株，其中，ZJ01TK^-/gE^-/gI^-的DNA序列为将ZJ01序列去除序列表1-2的序列所述序列后所得序列。

本发明所述的毒株，其中，ZJ01的GeneBank DNA序列号为KM061380.1。

本发明所述的毒株，其中，TK的DNA序列为序列表1的序列。

本发明所述的毒株，其中，gE的DNA序列为序列表2的序列。

本发明所述的毒株，其中，gI的DNA序列为序列表2的序列。

序列表2的序列为gE/gI基因序列融合在一起的序列。

本发明所述的毒株，以PRV ZJ01株为原始毒株经过基因结构改造得到，其中PRV ZJ01株由本实验室于2012年2月分离自浙江某规模猪场发病仔猪，属高致病性毒株，为BHK-21细胞F8代适应毒。本发明以PRV ZJ01毒株为亲本构建的毒株为TK、gE和gI基因缺失病毒，为BHK-21细胞F10代适应毒。

本发明的毒株已经保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC No.10397，保藏日期2015年02月3日，分类命名：猪伪狂犬病毒，PRV-ZJ01R，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的病毒毒株，其制备方法的设计方案为：