[发明专利]一种通过表面展示实现人源精氨酸酶‑1固定化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是人源精氨酸酶-1(Human Arginase1)的固定化技术，特别是通过优化的冰核形成蛋白展示来实现固定化的方法，是人源精氨酸酶Ⅰ固定化的一种新思想、新途径、新方法。

背景技术

人源精氨酸酶-1以三聚体的形式存在于人肝脏细胞之中，参与尿素代谢循环，催化水解L-Arg(L-精氨酸)生成L-Orn(L-乌氨酸)和尿素。精氨酸酶Ⅰ缺陷，会导致发育迟缓，智力缺陷，癫痫和运动失调等一系列相关疾病，人源精氨酸酶-1还可以用于做为药物治疗癌症。

由于大部分精氨酸酶难以实现在大肠杆菌中实现高效可溶性表达，从肝脏中提取精氨酸酶作为精氨酸酶主要的来源，但存在着可能携带各种病毒的风险。人源精氨酸酶-1在巴斯德毕赤酵母能够实现有效的分泌表达，纯化的人源精氨酸酶-1，经过几丁质包埋固定以后，实现有效的转化L-Arg合成L-Orn，然而，此固定化方法，制备时间较长，制备过程复杂，在操作过程中，存在损失部分酶活等缺点。

大肠杆菌表面展示技术，作为一种全新的固定技术，有广泛的应用前景，诸如，将谷氨酸脱羧酶展示在大肠杆菌表面，重组大肠杆菌细胞可作为“固定化细胞工厂”来转化谷氨酸生产药物中间体γ-氨基丁酸；将腈水解酶展示在大肠杆菌细胞表面，重组大肠杆菌细胞可作为“固定化细胞分子筛”拆分手性化合物邻-6-扁桃酸；将有机磷水解酶展示大肠杆菌表面，重组大肠杆菌细胞作为“固定化生物吸附剂”降解环境存在的有害有机磷试剂；

简述现有技术冰核形成蛋白展示系统。冰核形成蛋白来源于假单胞菌，作为锚定蛋白，可以通过磷脂酰基醇(GPI)锚定在大肠杆菌细胞外膜，利用这一特征，人们已开发为一类在大肠杆菌表面展示异源蛋白的展示系统。冰核形成蛋白由三部分组成，氨基端功能域，高度重复区域和羧基端功能域。据报道，全长的冰核形成蛋白，氨基酸端剪切突变体，羧基端剪切突变体和去掉重复序列的剪切突变体都可以介导异源蛋白在大肠杆菌表面展示。然而，现在的冰核形成蛋白展示系统，不能有效的实现多聚体蛋白的表面展示及其固定化。通过不断地努力和改进，人们期待研究出高效的，广泛实用的冰核形成蛋白展示系统，来满足各种科研和生产需求。

发明内容

本发明提出了一种通过表面展示实现人源精氨酸酶-1固定化的方法，提供了一种全新的，有效的人源精氨酸酶-1固定化的方法。

设计在冰核形成蛋白剪切变体(InaK-N)的氨基端分别融合信号肽(Sec信号肽和Tat信号肽)和带电荷多肽(6×Lys,6×Glu和6×Asp)，在羧基端融合人源精氨酸酶-1，并在其羧基端设计HA标签，便于检测展示效率；

1)首先，设计PCR引物分别携带编码信号肽Sec、Tat，带电荷多肽6×Lys、6×Glu、6×Asp和标签蛋白HA的序列(信号肽和带电荷多肽及其氨基酸序列见表1和附图1，附图2)，通过PCR将其分别融合在冰核形成蛋白剪切变体(InaK-N)的氨基端，和人源精氨酸酶-1的羧基端，然后将两类基因片段通过PCR融合在一起，构建出含有各种含有冰核形成蛋白和精氨酸酶重组表达质粒；

所述引物名称及引物序列见表2

表1 信号肽和带电荷多肽及其氨基酸序列

表2 引物名称及引物序列

a引物方向为5’-3’

2)将构建好的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta Blue感受态细胞，37℃静置培养过夜，获得基因工程菌株；

3)将基因工程菌株，接种于100mL LB培养基，氨苄青霉素的终浓度为50μg/mL，37℃震荡培养，OD值为0.5～0.6之间，加入IPTG，终浓度为1mM，37℃震荡培养8小时。然后，12000RPM，4℃，10分钟离心收集菌体，菌体用预冷磷酸缓冲液清洗2次，去掉残留的培养基，重悬于10mL的预冷磷酸缓冲液中备用；

4)分别取200μL重悬的菌液，细胞经荧光抗体标记后，用流氏细胞术(Flow Cytometry,FCM)分析不同的信号肽和带电荷多肽展示人源精氨酸酶-1的效率；